不同季节柿叶中黄酮类成分含量的动态变化及抗氧化活性研究

胡秀梅，邓向军，武谦虎

(1.镇江市第一人民医院药剂科，江苏 镇江　212002；2.镇江市第三人民医院药剂科，江苏 镇江　212000)

◇药物分析◇

不同季节柿叶中黄酮类成分含量的动态变化及抗氧化活性研究

胡秀梅1，邓向军1，武谦虎2

(1.镇江市第一人民医院药剂科，江苏 镇江212002；2.镇江市第三人民医院药剂科，江苏 镇江212000)

摘要：目的研究不同季节柿叶中芦丁和总黄酮含量的动态变化及其抗氧化活性。方法采用反相高效液相色谱法对不同生长季节柿叶中芦丁含量进行测定；采用紫外分光光度法对不同生长季节柿叶总黄酮含量进行测定；采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力测定和总抗氧化性能测定，研究不同生长季节柿叶的抗氧化活性。结果柿叶中芦丁含量在8月份最高；柿叶中总黄酮含量在9月份最高；柿叶的抗氧化活性9月份最强。结论柿叶中的黄酮类成分含量和抗氧化活性与生长季节有关，柿叶的抗氧化活性还可能与其黄酮类成分含量有关，为柿叶的采收及应用提供了一定的科学依据。

关键词：柿属;芦丁;黄酮类;采收期

柿叶为柿树科(Ebenaceae)柿树属(Diospyros)植物柿(DiospyroskakiL.f.)的新鲜或干燥叶，味苦，性寒，具有生津止渴、清热解毒、润肺强心、镇咳止血等功效。柿叶作为药用，始载于明朝《滇南本草》，曰“经霜叶敷臁疮”；《本草再新》记载用于“治咳嗽吐血，止渴生津”。现代药理研究表明[1-3]，柿叶及其所含黄酮类、酚类、鞣质类等化合物具有抗氧化、抗菌、止血、减肥降脂、降血糖、保护心血管等作用。Han等[4]研究发现，柿叶中黄酮类化合物具有明显的清除自由基效应，能明显抑制人中性粒细胞中过氧化物的产生。据此认为，柿叶黄酮类化合物具有明显的抗氧化作用，其有开发为新型天然抗氧化剂的潜力[5-7]。

目前已有文献报道[8]采用分光光度法测定柿叶药材总黄酮含量，但系统研究不同生长季节柿叶中芦丁和总黄酮成分含量及其抗氧化活性的动态变化还未见报道。为此，本实验采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定柿叶中芦丁含量；紫外分光光度法测定总黄酮含量；采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力测定和总抗氧化性能测定，对不同采收期柿叶芦丁、总黄酮含量的动态变化和抗氧化活性进行系统地研究，为柿叶药材的适时采收利用提供依据。

1材料与仪器

1.1材料与试剂柿叶，2014年5～11月采自镇江南山，经武谦虎主任中药师鉴定为柿树科植物柿DiospyroskakiL.f.的叶，低温干燥后备用；DPPH，美国Sigma公司；磷酸钠、钼酸铵、浓硫酸，国药集团化学试剂有限公司；色谱分析用甲醇，江苏汉邦科技有限公司；其余试剂均为分析纯。芦丁标准品，中国药品生物制品检定所，批号：0844-200003。

1.2仪器与设备JASCO LC1500高效液相色谱系统，日本分光公司；Inertsil ODS-3分析柱，日本 GL Science 公司；UV-2102PCS型紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)分析仪器有限公司；HHS-1恒温水浴锅，上海浦东跃新科学仪器厂；MP502B电子天平，上海精密科学仪器有限公司；1810-B型自动双重纯水蒸馏器，上海申立玻璃仪器公司。

2方法与结果

2.1供试品溶液的制备

2.1.1芦丁供试品溶液的制备前期实验采用以芦丁得率为指标，响应面优化提取工艺，确定了柿叶中芦丁最佳提取工艺为：称取5 g干燥的柿叶粉末于250 mL的烧瓶中，加入100 mL甲醇，索氏回流提取6 h后，回收甲醇，残渣用甲醇溶解并定容至100 mL，备用。

2.1.2总黄酮供试品溶液的制备前期实验采用以总黄酮得率为指标，响应面优化提取工艺，确定了柿叶中总黄酮最佳提取工艺为：柿叶粉末1 g，加70%乙醇20 mL，回流提取3次，每次3 h，过滤回收乙醇后，定容至100 mL量瓶中，得供试品溶液。

2.2对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的芦丁对照品10.1 mg，置10 mL容量瓶中，甲醇定容制得浓度为1.01 g·L-1的芦丁对照品溶液。

2.3空白溶液的制备以甲醇作为空白样品溶液，精密吸取20 μL进样分析。

2.4色谱条件色谱柱(测定芦丁)：Kromasil C18柱(250 nm×4.6 nm，5 μm)；测定芦丁含量的流动相：甲醇—水(49∶51) ，流速1 mL·min-1，检测波长365 nm；进样量20 μL，按外标法计算含量。对照品、空白对照和样品色谱图见图1。

2.5标准曲线和线性范围考察

2.5.1HPLC芦丁标准曲线精密量取一定体积的1.01 g·L-1的芦丁对照品溶液，用甲醇分别稀释成 6.31、12.62、25.25、50.5、101 mg·L-1溶液。取上述对照品溶液过0.45 μm滤膜，取续滤液20 μL进样分析，以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=17 854X+3111.2，r=0.999 9，结果表明芦丁在6.31～101 mg·L-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5.2UV芦丁标准曲线精密量取芦丁对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于15 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠1 mL，摇匀，放置6 min；再加10% 硝酸铝1 mL，摇匀，放置6 min；再加1 mol·L-1氢氧化钠2 mL，加甲醇补至15 mL，摇匀，放置10 min，于510 nm波长下测吸光度。以吸光度A对浓度C线性回归，得标准曲线方程Y=0.002 5X+0.162 3，r=0.999 1。芦丁在33.67～ 168.33 mg·L-1范围内线性关系良好。

注：芦丁对照品(A)、空白样品(B)、柿叶样品(C)。

图1HPLC色谱图

2.6精密度试验精密量取“2.2” 项中配制的芦丁对照品溶液，按“2.5.1” 项测定方法连续进样6次，计算芦丁峰面积的RSD为1.86%(n=6)。表明HPLC仪器的精密度良好。按“2.5.2” 项测定方法，显色后测定吸光度，计算吸光度RSD为1.37%(n=6)。实验表明UV仪器的精密度(重现性)良好。

2.7重复性试验精密量取同一批次的芦丁供试品溶液6份，按“2.5.1” 项测定方法连续进样6次，计算芦丁含量的RSD为1.74%(n=6)，实验表明重复性良好。

2.8稳定性试验精密量取芦丁供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，计算芦丁峰面积的RSD为1.28 %(n=6)表明芦丁供试品溶液在24 h内稳定；精密吸取总黄酮供试品溶液，加显色剂显色后，每1 h测定一次吸光度，连续测定6 h，计算吸光度RSD为2.04 %(n=6)表明总黄酮供试品溶液显色后在6 h内显色稳定。

2.9加样回收率试验精密称取已知芦丁含量的柿叶粉末，加入定量的芦丁对照品，按“2.1.1”项制备样品溶液，各平行6份，按“2.5.1” 项测定方法进行测定，芦丁的加样回收率为99.87%，RSD 为1.13%(n=6)；精密称取已知总黄酮含量的柿叶粉末，加入定量的芦丁对照品，按“2.1.2”项制备样品溶液，各平行6份，按“2.5.2” 项测定方法进行测定，取1 mL显色，总黄酮含量以芦丁计，计算回收率为99.29%，RSD 为1.46 %(n=6)。

2.10样品含量测定

2.10.1不同采收期柿叶中芦丁含量的测定精密称取不同采收期的柿叶粉末，按“2.1.1”项下方法制备成芦丁供试品溶液，按“2.5.1” 项测定方法对不同采收期柿叶中芦丁的含量进行测定，每个采收期的柿叶制备3份，每份样品连续测定3次，计算芦丁的平均含量。柿叶芦丁含量随生长季节的变化趋势见图2。

图2　不同采收期柿叶中芦丁含量动态变化

2.10.2不同采收期柿叶中总黄酮含量的测定精密称取不同采收期的柿叶粉末，按“2.1.2”项下方法制备成芦丁供试品溶液，按“2.5.2” 项测定方法对不同采收期柿叶中总黄酮的含量进行测定，每个采收期的柿叶制备3份，每份样品连续测定3次，计算总黄酮的平均含量。柿叶总黄酮含量随生长季节的变化趋势见图3。

图3　不同采收期柿叶中总黄酮含量动态变化

2.11不同采收期柿叶的抗氧化活性的测定

2.11.1DPPH自由基清除能力测定精密称取不同采收期的柿叶粉末，按“2.1.2”项下方法制备成供试品溶液，稀释浓度为1 g·L-1，分别取100、200、400、600、800 μL于具塞试管中，各自补充蒸馏水至1 mL，加入去离子水溶液2 mL，0.1 mmol·L-1DPPH溶液(精密称取4 mg DPPH，用无水乙醇定容至50 mL)1 mL ，摇匀，黑暗处静置30 min后，用去离子水调零，测定517 nm处吸光度A样品，再测定1 mL不用浓度的样品溶液与3 mL 去离子水混合液在517 nm处的吸光度A对照，同时测定1 mL DPPH溶液与3 mL去离子水在517 nm处的吸光度A空白。VC作阳性对照，DPPH清除率按式(1)计算。柿叶DPPH自由基清除能力随生长季节的变化趋势见图4。

DPPH清除率=[A空白-(A样品-A对照)/A空白]×100%

(1)

图4　不同采收期柿叶清除DPPH能力比较

2.11.2总抗氧化能力的测定精密称取不同采收期的柿叶粉末，按“2.1.2”项下方法制备成供试品溶液，稀释浓度为1 g·L-1，分别取100、200、400、600、800 μL于具塞试管中，各自补充去离子水至1 mL，各加3 mL混合液(精密称取磷酸钠1.065 g，钼酸铵0.494 g，用少量去离子水溶解后加浓硫酸3.28 mL，定容于100 mL容量瓶中得)，加塞于95℃水浴中加热90 min，取出后流水冷却至室温，用去离子水调零，在695 nm处测定吸光度。依据波长695 nm处的吸光度变化来衡量不同采收期的柿叶总抗氧化性能的高低。柿叶总抗氧化能力随生长季节的变化趋势见图5。

3讨论

本实验系统研究了不同生长季节的柿叶中芦丁和总黄酮含量的动态变化以及其抗氧化活性的变化，不同生长季节的柿叶中芦丁和总黄酮含量均有一定的差异性，且抗氧化活性呈现先升高后降低的趋势。

图5　不同采收期柿叶总抗氧化能力比较(A=695 nm)

不同生长季节的柿叶中，芦丁含量从5月份开始逐渐升高，到8月份含量达到最高，之后又开始降低，10月份霜降以后，含量急剧下降。柿叶总黄酮含量变化趋势与芦丁基本相同，即含量从5月份开始逐渐升高，到9月份含量达到最高，9月份以后又开始降低，10月霜降以后含量急剧降低。这些变化提示，柿叶中芦丁和总黄酮含量含量可能与温度有关，7、8、9月份气温高，黄酮成分含量升高，10月份霜降后温度降低，黄酮成分含量下降，这与韩卫娟等[9]研究不同(品)柿叶中总黄酮含量年动态变化基本一致，总黄酮含量高峰时期分别集中在7月和8月中下旬。但具体机制有待进一步研究。

不同生长季节的柿叶均具有一定的清除DPPH能力，且随着各浓度的增大，清除DPPH自由基能力逐渐呈上升趋势。而在一定浓度范围内，柿叶清除DPPH能力从5月份开始逐渐增强，8、9月份最强，9月份强与阳性对照Vc相当，10、11月份又逐渐降低。同样，不同生长季节的柿叶也具有一定的总抗氧化的能力，且随着各浓度的增大，总抗氧化的能力逐渐呈上升趋势。而在一定浓度范围内，柿叶总抗氧化的能力从5月份开始显著增强，8、9月份最强，与阳性对照Vc相当，10、11月份又明显降低，变化趋势较明显。总之，不同生长季节的柿叶都具有一定的抗氧化能力，但存在一定的变化趋势，其与黄酮类成分含量的动态变化趋势相同，表明不同生长季节的柿叶的抗氧化活性可能与其黄酮类成分含量有关，孙彩云等[10]半仿生提取柿叶黄酮也证明了柿叶总黄酮对油脂过氧化、DPPH 自由基、羟基自由基、超氧自由基均有一定的抑制作用。结果表明柿叶黄酮类化合物是一种很有潜力的天然、安全、高效的抗氧化剂[11]。但其具体机制有待进一步研究。

本实验初步揭示了不同生长季节柿叶中芦丁和总黄酮含量及其抗氧化活性的变化规律，实验结果提示在柿叶的利用上，应重视其不同季节所含的成分和活性的变化，根据柿叶不同有效成分的功效，合理安排采收时间以利于柿叶资源和产品开发[12]及临床应用。

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Dynamic change of flavonoids content and the antioxidant activities in persimmon leaves from different growing seasons

HU Xiu-mei1，DENG Xiang-jun1，WU Qian-hu2

(1.TheFirstPeople’sHospital,Zhenjiang,Jiangsu212002,China;2.TheThirdPeople’sHospital,Zhenjiang,Jiangsu212000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the variation of rutin and total flavonoids content and the antioxidant activities in persimmon leaves from different growing seasons.MethodsThe rutin content was determined by high performance liquid chromatography.The total flavonoids content was determined by UV.The antioxidant activities in persimmon leaves from different growing seasons were evaluated with DPPH radical scavenging assay and total antioxidant assay.ResultsRutin and total flavonoids reached their highest contents in persimmon leaves in August and September respetively.The antioxidant activity reached highest in persimmon leaves in September.ConclusionsThe flavonoid content and antioxidant activity of persimmon leaves were associated with the growing seasons,and antioxidant activity may also be associated with flavonoids content of persimmon leaves,which provided certain scientific basis for the collection and application of persimmon leaves.

Key words:Diospyros;Rutin;Flavones;Collecting Periods

通信作者:武谦虎，男，主任中药师， 研究方向:中药药理学及临床药学,E-mail:wuqihu2003@163.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.05.011

(收稿日期：2016-01-25，修回日期：2016-03-14)