MCT1 MMP-2mRNA在人脑胶质瘤的表达及相关性研究

寿记新　高海东　王建业　刘菲菲　付旭东　王　酩　丁攀峰　孟恩平　周少龙

郑州大学第五附属医院　郑州　450052

MCT1 MMP-2mRNA在人脑胶质瘤的表达及相关性研究

寿记新高海东△王建业刘菲菲付旭东王酩丁攀峰孟恩平周少龙

郑州大学第五附属医院郑州450052

【摘要】目的探讨单羧酸转运蛋白-1(MCT1)和基质金属蛋白酶2(MMP-2)mRNA在人脑胶质细胞瘤中的表达及相关性。方法应用荧光定量qRT-PCR法，分别测定50例原发性人脑胶质细胞瘤和10例脑内减压术患者脑组织标本中MCT1、MMP-2 mRNA表达水平。结果(1)MCT1、MMP-2在人脑胶质细胞瘤组织中mRNA表达较对照组显著增强(P<0.05)；(2)MCT1、MMP-2在高级别胶质瘤组较低级别胶质瘤组mRNA表达显著增加(P<0.05)；(3)MCT1、MMP-2mRNA在胶质瘤中的表达可能具有正相关性(r=0.712，P=0.001)，对照组标本中均未见明显MCT1、MMP-2mRNA表达。结论(1)MCT1、MMP-2mRNA的表达同胶质瘤恶性级别关系密切，且病理级别越高其表达强度明显增强；(2)MCT1、MMP-2mRNA表达可能协同参与了人脑原发性胶质瘤的病理发展过程；(3))MCT1、MMP-2mRNA关联检测有可能作为判断胶质瘤侵袭性及其预后的重要参考指标。

【关键词】单羧酸转运蛋白-1；基质金属蛋白酶-2；脑胶质瘤

作为颅脑肿瘤中当前较多见的原发性人脑胶质瘤[1]，目前仍无理想的根治措施，已有研究证明，其病理分级越高侵袭性越强，且其详细发病机制尚不清楚[2]。最新研究表明单羧酸转运蛋白-1(MCT1)在胶质瘤的一系列病理演变中具有一定的推动作用[3]，并与胶质瘤的恶性程度关系密切。Miranda-Gonçalves等[4]发现，与弥漫性星形细胞瘤和非肿瘤脑组织相比，脑神经胶质瘤组织的细胞膜上MCT1的表达明显增强。另有报道，具有侵袭能力的胶质瘤细胞能够分泌大量MMP-2，同时其侵袭力与MMP-2的表达水平密切相关[5]；但二者在胶质瘤中的表达水平及其相关性，目前研究报道尚少，本文旨在探讨在原发脑胶质瘤的发生及恶变过程中二者mRNA的表达及其相关性，以期提供一定的数据供实验及临床参考应用。

1资料与方法

1.1病例资料选取我院神经外科2012-07-2015-05，术中切除并经组织学病理切片证实的原发性人脑胶质瘤组织标本50例为研究对象(观察组)，男28例，女22例；年龄21～74岁，平均(48±11)岁，中位年龄46岁。按照《WHO中枢神经系统肿瘤组织学分类》(2007)标准进行分级分类，Ⅰ～Ⅱ级共21例作为低度恶性组(其中少突胶质瘤10例，星形胶质瘤11例)，Ⅲ～Ⅳ级共29例为高度恶性组(其中少支胶质细胞瘤4例，混合性胶质瘤7例，恶性星形胶质瘤18例)，同时筛选本院神经外科病区，相同时期因脑损伤后10例内减术脑外伤患者的脑组织为对照组，所有选取的脑胶质瘤标本均经石蜡常规性包埋及10%甲醛进行固定。

1.2主要试剂、仪器高纯总RNA提取试剂盒(购自上海吉凯生物公司)；按照总RNA提取试剂盒说明书严格操作，同时将获得总RNA纯度通过微量紫外光度计进行测定并定量，A260：A280在1.692～1.913，满足实验需要。MCT1、MMP-2、β-actin基因引物序列由Primerpremier7.0软件设计引物，TaKaRa公司合成。引物序列如下：

MCT1f：5'-TGAAGTGCTAGGAGGCG-GA-3'，

r：5'-ACGTCTTCAAGGTGCTGTTCAT-3’；

MMP-2f：5'-ACCCCAACGTACACCCCGAT-3'，

r：5'-CGCGAGAACCCAACTCCTCC-3'；

β-actinf：5'-AGCCGTGGACATCCGCAAAG3'，

r：5'-GTGGAAG-GTAGACAGCGAGG-3'

1.3RT-PCR反应测定各级别胶质瘤MCT1、MMP-2mRNA表达实时荧光定量PCR反应体系：通过qRT-PCR试剂盒中的M-MLV第一链合成得到的第一链体系，获得cDNA，在—20℃下保存备用。且将β-actin作为内比照，运用qRT-PCR(美国罗氏LightCycler480)RT-PCR反应体系：4×qPCRMix10μL，上游引物20pmol(2μL)，20pmol(2μL)下游引物，模板cDNA4μl，dH2O2μL，共20μL。反应条件：96 ℃ 10s，58 ℃ 40s，总扩增35个循环。然后，将所得到的qRT-PCR产物样品通过2%的琼脂糖凝胶电泳和熔解曲线给予鉴定，最后采用(2-△△CT)公式给予定量分析。

2结果

2.1MCT1mRNA在人脑胶质瘤及正常对照组中表达的比较在对照组、低度及高度恶性人脑胶质瘤3组标本中MCT1mRNA的表达水平比较差异具有统计学意义(P<0.05)，进一步两两比较显示上述3组标本中MCT1mRNA的表达强度逐次增强，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　2组MCT1表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与低度恶性组比较，#P<0.05

2.2MMP-2mRNA在胶质瘤及对照组标本中表达的比较在对照组、低度及高度恶性胶质瘤3组标本中MMP-2mRNA的表达比较差异具有统计学意义(P<0.05)，进一步两两比较显示，上述3组标本中MMP-2mRNA的表达强度逐次增强，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2　人脑胶质瘤和正常对照组中MMP-2的表达±s)

注：与对照组比较*P<0.05；与低度恶性组比较，#P<0.05

2.3在脑胶质瘤标本中MCT1和MMP-2mRNA表达的相关性运用Spearman相关分析法显示MCT1和MMP-2mRNA的表达可能具有正相关性关系(r=0.712，P=0.001)。

3讨论

脑胶质瘤作为当前发病率较高的颅脑肿瘤之一，其一旦发生往往具有血供丰富、浸润性生长及高复发率等生物学行为，在这一复杂的病理过程中胶质瘤肿瘤细胞不断汲取养分尤其是保持新生血管内皮细胞的更新代谢，维持肿瘤细胞微环境的相对稳定显得尤为重要，而单羧酸转运蛋白(mono-carboxylatetransporterproteins，MCTs)作为哺乳动物细胞膜上广泛分布的一类跨膜转运蛋白在糖酵解代谢(H+、乳酸转运)中发挥者不可替代作用[6]；且MCT1在人体内数量最多，分布最广对代谢和内环境调节的意义最为重要[7]。DeSaedeleer等[8]通过对多种人肿瘤细胞系的研究后发现，乳酸能够激活HiF-1并诱导肿瘤血管生成，而MCT1能够促进乳酸进入肿瘤细胞以供细胞呼吸，且还能促进血管内皮细胞迁移而诱导肿瘤血管生成及增强其侵袭性；同样已有研究表明，MMPs在胶质瘤的侵袭性中也具有促进作用，MMP-2[9-10]是一组含Zn2+的能降解基底膜的蛋白酶，主要降解明胶、胶原Ⅳ、胶原Ⅴ、层黏连蛋白、弹性蛋白及纤黏蛋白等，Chen等[11]实验表明，T98G胶质瘤系能分泌大量的MMP-2，而在ECM的培养基中生长良好且能沿着基底膜侵袭，本研究应用qRT-PCR法对低、高度恶性胶质瘤组以及正常对照组中MCT1、MMP-2mRNA的表达强度进行研究分析。结果显示，MCT1、MMP-2mRNA在胶质瘤组标本中的表达较正常对照组中的表达明显增强；提示：MCT1、MMP-2mRNA在原发人脑胶质瘤的病理及恶变过程中具有明显的推动作用；且MCT1、MMP-2mRNA具有胶质瘤恶性程度以及病理级别增高而表达逐渐增强的趋势，即MCT1、MMP-2mRNA的表达强度与原发人脑胶质瘤的恶性度呈正相关性，与Aruna等[12]采用胶原酶谱分析发现，MMP-2在多形胶质母细胞瘤中的酶活性比星形细胞瘤高，实验结论相似。

综上所述，本实验研究虽然仅对MCT1、MMP-2在原发性人脑胶质瘤中的mRNA表达作了定量分析，且原发性人脑胶质瘤的详细发病机制仍然不明，但初步揭示了MCT1、MMP-2在胶质瘤中所起的作用及二者之间的相关性，为进一步对胶质瘤的的发病机理等研究积累了数据和经验，并为胶质瘤基因靶点治疗进行了新的探索，二者共同检测有可能作为判断胶质瘤侵袭性及其预后的重要参考指标。

4参考文献

[1]程森，寿记新，付旭东，等.NS和PUMA蛋白在人脑胶质瘤中的表达及其临床意义[J].中华神经医学杂志，2014，13(12)：1 256-1 259.

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[6]HalestrapAP.TheSLC16genefamily-structure，roleandregulationinhealthanddisease.MolAspectsMed， 2013， 34(2-3)： 337-349.

[7]张宝月，瞿全新，顾安康，等CD147、MCT1及MCT4在宫颈病变中的表达及临床意义[J]国际妇产科学杂志2015，(42)2：194-196.

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[11]ChenY，TsaiYH，TsengSH.Valproicacidaffectedthesurvivalandinvasivenessofhumangliomacellsthroughdiversemechanisms[J].ournalofNeuro-Oncology，2012，109(1)：23-33.

[12]BadigaAV，ChettyC，KesanakurtiD，etal.MMP-2siRNAInhibitsRadiation-EnhancedInvasivenessinGliomaCells[J].PLoSOne，2011，6(6)：20 614.

(收稿2015-11-11)

基金项目：河南省科技厅项目(102300410065)

通讯作者：△高海东，E-mail：zdwfy9666@163.com

【中图分类号】R739.4

【文献标识码】A

【文章编号】1673-5110(2016)10-0031-02