银杏叶提取物对红藻氨酸致癫痫大鼠N-甲基-D-天冬氨酸受体及神经肽Y表达的影响

赵辰生

山西省心血管病医院神经内科　太原　030024

银杏叶提取物对红藻氨酸致癫痫大鼠N-甲基-D-天冬氨酸受体及神经肽Y表达的影响

赵辰生

山西省心血管病医院神经内科太原030024

【摘要】目的分析银杏叶提取物对红藻氨酸致癫痫大鼠N-甲基-D-天冬氨酸受体(NR2A)及神经肽Y(NPY)表达的影响。方法将64只实验大鼠随机分为4组，正常大鼠对照组16只，单纯癫痫模型组16只，银杏叶提取物预处理组16只，1，2-丙二醇溶液预处理组16只，后3组实验大鼠予以癫痫大鼠模型制作。造模成功后12 h，取各组大鼠脑组织制作标本。采用免疫组化方法检测标本海马组织NR2A及NPY蛋白的表达水平及阳性表达率。结果单纯癫痫模型组、1，2-丙二醇溶液预处理组NR2A的阳性表达率及表达水平高于正常大鼠对照组(P均<0.05)；银杏叶提取物预处理组NR2A阳性表达率及表达水平均低于单纯癫痫模型组及1，2-丙二醇溶液预处理组(P均<0.05)。单纯癫痫模型组、1，2-丙二醇溶液预处理组NPY阳性表达率及表达水平均高于正常大鼠对照组(P均<0.05)；而银杏叶提取物预处理组NPY阳性表达率及表达水平均高于正常大鼠对照组、单纯癫痫模型组及1，2-丙二醇溶液预处理组。单纯癫痫模型组与1，2-丙二醇溶液预处理组在NR2A及NPY表达比较上，差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论银杏叶提取物预处理给药有一定的抗癫痫作用，其抗癫痫的机制可能与上调NPY及下调NR2A的表达有关。

【关键词】癫痫；银杏叶提取物；N-甲基-D-天冬氨酸受体；神经肽Y

癫痫是在先天和后天多种因素共同作用下引起的以脑部神经元高度同步化异常放电为主要病理特征的一种神经功能紊乱性疾病。据相关数据统计显示，目前我国癫痫的发病率约为7.0‰，患病人数高达约900万人，已成为威胁人们身心健康和生活质量的重要疾病因素[1]。目前，癫痫的临床治疗以AEDs类抗癫痫药物治疗为主。但在长期的临床实践中，这类药物虽在一定程度上控制了疾病的发作，但仍有20%的患者存在反复发作的现象[2]；加之其突出的毒副反应对患者行为和认知功能造成的不利影响，大大制约了其临床应用价值。因此，寻找更高效、更安全、毒副作用小的新型抗癫痫药物成为神经内科医学工作者探讨的重要课题。而在悠久的药学进程中，中医药在癫痫的临床治疗上积累了丰富了经验。近年来，据相关研究报道显示，银杏叶提取物的主要成分—酮类和萜内酯因具有对抗脑内兴奋性氨基酸兴奋毒性的作用而可为癫痫的临床治疗开辟新的路径。本研究通过建立癫痫大鼠模型，在探讨银杏叶提取物对红藻氨酸致癫痫大鼠N-甲基-D-天冬氨酸受体(NR2A)及神经肽Y(NPY)表达的影响的基础上，分析其抗癫痫作用机制，现报告如下。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器红藻氨酸注射液(上海天呈医流科技股份有限公司提供)；银杏叶提取物761(西安天本生物工程有限公司提供)；1，2-丙二醇(天津市富宇精细化工有限公司提供)；苏木素(天津市赛瑞达生物工程有限公司提供)；兔抗大鼠NPY蛋白多克隆抗体(美国Bioworldtechnology)；大鼠脑立体定向仪(北京北瑞达医药科技有限公司提供)；电子显微镜(湖北省科学器材公司提供)。

1.2实验动物雄性SD大鼠64只，体质量250～300g，购自南方医科大学试验动物中心。

1.3方法(1)动物分组及给药：将64只大鼠随机分为4组，即正常大鼠对照组16只，单纯癫痫模型组16只，银杏叶提取物预处理组16只(予以大鼠银杏叶提取物761溶液注射)，1，2-丙二醇溶液预处理组16只(予以大鼠同体积的体积分数50% 1，2-丙二醇溶液注射)。(2)癫痫大鼠模型制作。4组大鼠中，正常大鼠对照组不予以模型制作，另3组大鼠予以模型制作。造模方法：首先，所有大鼠予以10%水合氯醛腹腔注射，脑立体定向仪定位大鼠头部，并减除毛发，局部消毒，铺巾；然后于大鼠头部正中线作长10～15mm的切口，再用30%的双氧水将颅骨上的腱膜、颅骨外膜腐蚀，促使前囟充分暴露，并于前囟后1mm钻孔；沿钻孔将装有红藻氨酸注射液的微量进样器进针，向侧脑室内将0.8μL的1μg红藻氨酸注射液注入，注射完毕后，留针5min后将针缓慢拔出[3]。最后，将大鼠颅骨处所钻的孔采用骨蜡封闭，再予以头皮缝合，放回笼中进行行为学监测。并按照Racine分级评价，IV～V级为癫痫造模成功；造模失败的大鼠按照相同的数量补充造模，直至成功[4]。

1.4NR2A及NPY表达的检测(1)标本制备：造模成功后12h，麻醉，胸腔剪开后使心脏完全暴露，穿刺针穿刺心尖，并剪开心脏放血。至肺脏变白后，于心脏内快速灌注4%多聚甲醛。待大鼠头尾及四肢变硬后，断头取脑，并固定于4 ℃ 4%多聚甲醛中。24h后取大鼠脑部前囟后2.5～4.5mm处的脑组织进行脱水包埋，制成蜡块。(2)NR2A及NPY表达的检测：取出厚约4μm的备用石蜡切片，采用免疫组化方法检测，以光学显微镜下细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性细胞判断标准，以镜下5个固定高倍视野(×400)阳性细胞数的均值计为海马组织NR2A及NPY蛋白的表达水平。同时，组织NR2A及NPY阳性表达的评定标准为：于每张标本切片中选染色最强最集中的5个高倍视野(×400)计算阳性细胞率，并予以分级：0级：比率<5%；1级：比率5%～25%；2级：比率25%～50%；3级：比率50%～75%；4级：比率>75%。然后，软色强度评价标准：阴性：0级；1级：弱阳性；2级：阳性；3级：强阳性。最后以阳性细胞率级别×软色强度级别/2≥0.5判断NR2A及NPY为阳性表达[5]。

2结果

2.1不同组大鼠海马组织NR2A的阳性表达率及表达水平比较从表1可以看出，单纯癫痫模型组、1，2-丙二醇溶液预处理组NR2A的阳性表达率及表达水平高于正常大鼠对照组(P均<0.05)；而银杏叶提取物预处理组NR2A阳性表达率及表达水平均低于单纯癫痫模型组及1，2-丙二醇溶液预处理组(P均<0.05)。单纯癫痫模型组与1，2-丙二醇溶液预处理组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表1　不同组大鼠海马组织NR2A的阳性表达率及

注：与正常大鼠对照组比较，aP<0.05；与正常大鼠对照组、单纯癫痫模型组、1，2-丙二醇溶液预处理组比较，bP<0.05

2.2不同组大鼠海马组织NPY的阳性表达率及表达水平从表2可以看出，单纯癫痫模型组、1，2-丙二醇溶液预处理组NPY阳性表达率及表达水平均高于正常大鼠对照组(P均<0.05)；而银杏叶提取物预处理组NPY阳性表达率及表达水平均高于正常大鼠对照组、单纯癫痫模型组及1，2-丙二醇溶液预处理组。单纯癫痫模型组与1，2-丙二醇溶液预处理组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

注：与正常大鼠对照组比较，aP<0.05；与正常大鼠对照组、单纯癫痫模型组、1，2-丙二醇溶液预处理组比较，bP<0.05

3讨论

红藻氨酸诱导下所建立的癫痫动物模型作为一种点燃癫痫模型，具有与人类癫痫极为接近的发作行为特征和海马硬化神经病理形态学改变，因而可作为一个优势生物模型工具，予以造模研究。本研究中，通过红藻氨酸致大鼠癫痫模型的建立，探讨银杏叶提取物预处理对大鼠NR2A及NPY蛋白表达的影响，以期在研究银杏叶提取物抗癫痫作用的基础上，阐明其作用机制，为癫痫疾病的临床治疗开辟新的路径。银杏叶提取物，主要由黄酮类和萜内酯类成分组成，其中，黄铜具有抗氧化、促进自由基清除的作用，而萜内酯则是目前药学领域中效果最强的血小板激活因子拮抗剂。诸多研究报道强调，银杏叶提取物预防给药能促进谷氨酸的神经毒作用大大减轻，降低神经元内的钙负荷，有效防止大脑皮质脂质的过氧化，控制神经元的丢失和破坏，进而对抗脑内兴奋性氨基酸产生的兴奋毒性作用，且这可能是其抗兴奋毒性的作用机制之一[6]。在此作用机制下，通过减轻兴奋性神经毒作用，降低钙超载正是抑制癫痫的反复发作的重要靶点。因此，银杏叶提取物具有一定的抗癫痫作用。目前，银杏叶提取物作为一种天然植物药物，因具有作用靶点多、不良反应少等优点，已在临床得到了广泛应用。

本研究结果显示：(1)银杏叶提取物预处理其抗癫痫的机制可能与下调NR2A的表达有关，也就是银杏叶提取物可能通过下调NR2A的表达抑制癫痫发作。即银杏叶提取物成份中应该至少有一种或多种成份能够抑制NR2A的表达，并通过其神经保护功能，能够减轻兴奋性神经毒作用，以发挥抗癫痫作用。NR属Glu离子型受体，而Glu则是脑内典型的兴奋性神经递质。诸多研究报道强调，NR功能的增强及NRmRNA表达上调，在惊厥的发生过程中及在癫痫易感性的形成过程中均发挥重要作用[7]。而NR2A作为NR的亚型，主要存在于大脑海马中。本研究检测结果显示，单纯癫痫模型组NR2A的阳性表达率及表达水平高于正常大鼠对照组，提示致癫痫过程中存在NR过度的激活。而银杏叶提取物预处理组NR2A阳性表达率及表达水平均低于单纯癫痫模型组及1，2-丙二醇溶液预处理组。由此可推测银杏叶提取物预处理其抗癫痫的机制可能与下调NR2A的表达有关。(2)银杏叶提取物预处理其抗癫痫的机制可能与上调NPY的表达有关。银杏叶提取物成份中应该至少有一种或多种成份能够上调NPY的表达，并通过其神经保护功能，能够减轻兴奋性神经毒作用，以发挥抗癫痫作用。NPY作为一种抑制性神经递质，可拮抗释放海马内Glu递质而发挥抗癫痫作用。目前已有大量研究报道证实，通过增加NPY的释放能有效减少痫样放电的持续时间，降低其发作频率[8]。本研究检测结果显示，单纯癫痫模型组NPY阳性表达率及表达水平均高于正常大鼠对照组，而银杏叶提取物预处理组NPY阳性表达率及表达水平均高于单纯癫痫模型组。提示，银杏叶提取物预处理其抗癫痫的机制可能与上调NPY的表达有关。

综上，银杏叶提取物预处理给药有一定的抗癫痫作用，其抗癫痫的机制可能与上调NPY及下调NR2A的表达有关。

4参考文献

[1]张小芬，俸军林，蒋静子，等.银杏叶提取物预处理对红藻氨酸致痫大鼠神经肽Y表达的影响[J].安徽医科大学学报，2013，48(8)：925-928.

[2]王芳，俸军林，张小芬，等.不同剂量银杏叶提取物对红藻氨酸致痫大鼠神经肽Y蛋白表达的影响[J].郑州大学学报(医学版)，2014，49(2)：207-210.

[3]仲玉洁，王金兰，陈琛，等.EGb761对慢性脑缺血大鼠认知功能及神经胶质细胞变化的影响[J].中国实用神经疾病杂志，2010，13(4)：11.

[4]董长征，赵文清，李文玲，等.重组腺相关病毒介导人源性神经肽Y基因转染对红藻氨酸致痫大鼠行为及脑电图的影响[J].第三军医大学学报，2010，32(19)：2 140.

[5]傅亚，谈宗华，胡承波，等.银杏叶提取物对中枢神经系统保护作用的研究进展[J].中国药房，2013，24(23)：2 196-2 199.

[6]张红萍，徐丽丹，俞忠明，等.注射用银杏叶提取物对小鼠神经系统的影响[J].浙江中西医结合杂志，2013，9(10)：794-796.

[7]张皓楠，王益民，王蕴华，等.银杏叶提取物对胎鼠皮质神经元细胞的影响[J].天津中医药大学学报，2012，(4)：219-220.

[8]孙宝枢.神经节苷脂对重型颅脑损伤患者术后神经功能的影响[J].中国实用神经疾病杂志，2013，17(19)：87-88.

(收稿2015-05-11)

【中图分类号】R-332

【文献标识码】B

【文章编号】1673-5110(2016)10-0045-02