猪苓微粉的膜分离及冷冻干燥效果

陆 宽，汪凯莎，刘建华，霍 昕，刘文炜，冯发进

（1.贵州省生物技术研究开发基地，贵州贵阳550002；2.贵州省中科院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳550002；3.贵阳中医学院第一附属医院，贵州贵阳550002）

加工贮藏·农产品质量

猪苓微粉的膜分离及冷冻干燥效果

陆 宽1，汪凯莎1，刘建华2，霍 昕1，刘文炜3＊，冯发进1

（1.贵州省生物技术研究开发基地，贵州贵阳550002；2.贵州省中科院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳550002；3.贵阳中医学院第一附属医院，贵州贵阳550002）

为有效利用并深度开发猪苓制品，采用膜分离技术将猪苓微粉提取液按膜孔径大小分离浓缩，对各截留段分离液采用冷冻干燥技术干燥，测定各截留段冻干粉得率和总糖含量。结果表明：猪苓微粉提取液按分离膜分子量大小被分成8段膜分离提取液，平均膜通量为6.93L／m2·h。分子段UF100猪苓微粉冻干粉得率最高，为1.05%；UF5得率最低，仅0.07%。NF400与UF10的总糖含量最高，分别为91.12%和88.00%；NF200以下总糖含量最低，为34.15%。药材中UF100的冻干粉总糖含量占比最高，为0.76%；NF400次之，为0.35%。

猪苓微粉；提取；膜分离；冷冻干燥

猪苓多糖（Polyporus polysaccharide）是猪苓中的活性成分，具有增强免疫、抗肿瘤、抗乙肝、抗氧化及抗辐射［1－7］等活性，且市售的猪苓产品以猪苓总糖为主要功能物质，多用于辅助治疗［8－9］。目前，猪苓的提取方法主要为传统的提取方法，存在操作繁琐，耗能高、耗时长等缺点，并且主要集中在对其总糖活性方面的研究，而针对不同分子量猪苓提取物的活性研究较少。近年来，膜分离技术在中草药生产和研究中已得到广泛应用［10－14］。膜分离技术具有生产能耗低、工艺流程短、可在常温低压下连续操作等优点，并且根据试验需要，可以分离得到不同分子量段的分离物，并对其进行针对性的研究。因此，笔者对猪苓微粉进行有机溶剂除杂后，以水作为提取剂进行提取，对提取液采用膜分离技术，分离得到不同分子量段分离物采用冷冻干燥技术对各截留段分离液进行干燥，并对所得各截留段冻干粉中总糖含量及分布进行研究，计算各截留段总糖含量在药材中所占比例，为猪苓微粉不同分子量段分离物免疫活性研究奠定基础，也为猪苓制品的进一步研究开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

药材及试剂：猪苓药材（产地：四川，购自贵州同济堂中药饮片厂），微晶纤维素（曲阜市天利药用辅料有限公司），葡萄糖对照品（中国药品生物制品检定所），D－无水葡萄糖对照品（购于中国药品生物制品检定所），其他试剂均为国产分析纯。

仪器：膜分离装置（国产组装），TU－1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），AL－204型电子天平（上海梅特勒－托得多仪器有限公司），冷冻干燥机（丹麦Heto－Holten公司），超滤膜（深圳市嘉泉膜滤设备有限公司），纳滤膜（合肥禹王膜工程技术有限公司）。

1.2 猪苓微粉制备

参照文献［15］进行，取猪苓药材，在－15～－20℃温度条件下微粉碎30min，过300目筛，制得猪苓微粉备用。

1.3 猪苓微粉水提液膜分离

称取猪苓微粉300g，依次用石油醚、乙酸乙酯和乙醇各500mL浸提脂溶性成分，滤过，沉淀挥去残余有机溶剂，加入200倍水，温浸提取2次，每次1h，过滤，合并滤液。滤液中加入微晶纤维素200g，沉淀过夜，离心，收集上清液浓缩至15 000mL，分别用超滤膜（UF）切割分子量（MWCO）100000、MWCO 50000、MWCO 10000、MWCO 5000及纳滤膜（NF）MWCO 800、MWCO 400、MWCO 200进行分离处理，工作参数：UF膜操作压力为0.13～0.15，溶液温度为30～40℃；NF膜操作压力为0.2～0.4，溶液温度为30～40℃。

1.4 猪苓微粉水提液不同截留段的冷冻干燥

分别对不同分子量段分离液进行冷冻干燥，考查各分子量段分离液在冷阱－40℃制冷所需时间、解析温度及解析时间，确定冷冻干燥工艺参数，收集冻干粉，计算得率。

1.5 总糖含量测定

1.5.1 总糖标准曲线的绘制 精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖对照品50.05mg，加水制成1.001mg／mL对照品溶液，各精密吸取上述溶液0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL和5.0mL置于50mL容量瓶中，加水定容，摇匀，得对照品系列液。各精密吸取2mL置于具塞试管中，加入0.05mL 80%苯酚溶液摇匀后迅速加5.0mL浓硫酸摇匀，室温放置10min后，于25℃水浴中放置15min，冷却，以纯化水作空白，采用分光光度法，在波长490nm处测定吸光度［16］。以横坐标为浓度，纵坐标为吸收度，绘制标准曲线。

1.5.2 猪苓微粉水提液在不同截留段的总糖含量精密称取各分子量段冻干粉50mg，分别置于50mL容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀。精密吸取1mL，置于50mL容量瓶中，加水定容，摇匀，即得供试品溶液。按1.5.1测定猪苓微粉提取液各截留段总糖含量，以及各截留段总糖占猪苓药材的比例。

2 结果与分析

2.1 猪苓微粉水提液膜分离效果

通过膜分离，得到8段截留液。由图1～2可知，随着猪苓微粉水提液通过不同分子量膜，水提液颜色由最初的棕色浑浊变为澄清透明。并且，不同截留段膜通量各不相同，说明猪苓微粉水提液中各物质按分子量大小被不同分子量段膜拦截，导致各截留段膜通量不同，随着被截留物质越来越多，使得NF200截留段膜通量增大，膜分离平均膜通量为6.93L／（m2·h）。由表1可知，猪苓微粉水提液按分子量大小不同被分成8段，浓缩时间为37h，NF200以上物质的体积浓缩比为16%时的浓缩效果较好。

图1 猪苓微粉水提原液及不同截留段分离液的颜色Fig.1 Color of Original P.umbellatus micro powder extracting solution and different separation solutions with different retention level

图2 猪苓微粉水提原液不同截留段的膜通量变化Fig.2 Membrane flux of P.umbellatus micro powder extracting solutions with different retention level

表1 猪苓微粉水提液不同分子量膜段浓缩的效果Table 1 Concentration of P.umbellatus micro powder extracting solutions with different molecular weight

表2 猪苓微粉提取液各截留段冷冻干燥工艺的参数及干粉得率Table 2 Technoloqical parameter of freeze－drying of the membrane separation of P.umbellatus extract

2.2 猪苓微粉分离液不同截留段冷冻干燥的效果

从表2可知，不同分子量段物料冷冻干燥的工艺不同。－40℃冷阱条件下，物料制冷时间均小于4h；升华干燥温度及时间随物料不同呈现不同变化；解析干燥温度在70℃以内，解析干燥时间因溶质不同而异。UF100冻干粉重量为3.15g，得率最高，为1.05%；UF5冻干粉重量为0.20g，得率最低，仅为0.07%。

2.3 猪苓微粉分离液不同截留段总糖含量及在药材中所占比例

由图3可知，NF400与UF10截留段分离物总糖含量最高，分别为91.12%和88.00%，而其他分子量段均不到80%，NF200以下分子段总糖含量最低，为34.15%。UF100分子量段冻干粉总糖含量在药材中的占比最高，为0.76%；NF400次之，为0.35%；UF5总糖含量最低，为0.04%。

图3 猪苓微粉提取液各截留段冻干粉总糖含量及在药材中所占比例Fig.3 Total sugar content of P.umbellatus micro powder extracting solutions with different retention level and their proportions in medicinal materials

3 结论与讨论

试验采用超滤膜及纳滤膜对猪苓微粉水提液进行分离浓缩。结果表明，提取液按分子量大小不同被分成8段，平均膜通量为6.93L／（m2·h），NF200以上物质的体积浓缩比为16%，浓缩效果良好。并且与传统分离方法相比，采用膜分离技术使工艺流程简化，成本降低，分离效率提高。通过冷冻干燥试验，确定在－40℃冷阱条件下，不同分子量截留段物料的冷冻干燥工艺。且UF100得率最高，为1.05%；UF5得率最低，仅为0.07%。通过对不同截留段总糖含量测定发现，NF400与UF10截留段分离物总糖含量最高，分别为91.12%和88.00%；NF200以下分子段总糖含量最低，为34.15%；而UF100分子量段冻干粉总糖含量在药材中所占比例最高，为0.76%；NF400次之，为0.35%。说明猪苓药材中总糖主要分布在UF100分子量段和NF400分子量段，为猪苓微粉提取以及功能产品开发提供了参考数据。

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（责任编辑：孙小岚）

Application of Membrane－separation and Freeze－drying Technology in Polysaccharide Extraction of Polyporus umbellatus

LU Kuan1，WANG Kaisha1，LIU Jianhua2，HUO Xin1，LIU Wenwei3＊，FENG Fajin1
（1.Development Base，Guizhou Biotechnology Institute，Guiyang，Guizhou550002；2.Guizhou Key Laboratory of Natural Product Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Guiyang，Guizhou 550002；3.First Affiliated Hospital，Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou550002，China）

The extracting solution of P.umbellatus micro powder was separated and concentrated according to membrane pore size by the membrane－separation technology and the dry powder rate and total sugar content of different separation solutions from different retention level were determined to effectively utilize and deeply develop P.umbellatus product.Results：Eight extracting solutions of P.umbellatus micro powder are divided into according to separation membrane pore size and the average membrane flux is 6.93L／m2h.The freeze－dried powder rate of P.umbellatus micro powder with UF100molecular level is the highest（1.05%）and the freeze－dried powder rate of P.umbellatus micro powder with UF5molecular level is the lowest（0.07%）.The total sugar content of P.umbellatus micro powder with NF400，UF10 and below NF200molecular level is 91.12%，88.00%and 34.15%separately.The total sugar proportion in the freeze－dried powder with UF100molecular level is the highest（0.76%），followed by the freezedried powder with NF400（0.35%）.

Polyporus umbellatus micro powder；extraction；membrane separation；freeze－drying

S38；R283.4

A

1001－3601（2016）08－0352－0109－03

2015－12－02；2016－06－30修回

贵州省社会发展科技攻关项目“猪苓、茯苓多糖制剂膜分离及生物活性研究”［黔科合SY字（2012）3080］；贵州省开发类科研院所技术开发研究专项资金“生物基地技术转化中试平台建设”［黔科合成字（2013）5028］；贵州省科技人才建设项目“贵州省药物固体制剂中试研究科技创新人才团队”［黔科合人才团队（2014）4011］

陆 宽（1987－），男，助理研究员，从事保健食品研发及中药研究。E－mail：wukong4608＠163.com

＊通讯作者：刘文炜（1982－），女，主管药师，从事中药制剂开发。E－mail：khliuwenwei＠163.com