双量子点纳米复合物NO比率荧光探针的合成与应用

李　娜，孙　捷*，王晓静，孙敬勇，王　兵

(1.济南大学 山东省医学科学院医学与生命科学学院，山东 济南 250062；　2. 山东省医学科学院药物研究所，山东 济南 250062)



双量子点纳米复合物NO比率荧光探针的合成与应用

李娜1,2，孙捷1,2*，王晓静1,2，孙敬勇1,2，王兵1,2

(1.济南大学 山东省医学科学院医学与生命科学学院，山东 济南 250062；2. 山东省医学科学院药物研究所，山东 济南 250062)

摘要：通过静电吸附作用，合成了CdSe@SiO2-CdTe双量子点的纳米复合物. 一氧化氮(NO)与CdTe量子点表面Cd离子结合形成Cd-NO复合物，引起CdTe量子点荧光猝灭，而不影响CdSe量子点的荧光. 当NO浓度在0.1～2.2 μmol/L之间变化时，该探针荧光强度比值I603/I532符合线性关系(R=-0.995 4)，从而实现对NO的定量检测.

关键词：NO；比率荧光；双量子点；CdSe@SiO2-CdTe

作为人体中产生的一种双原子自由基，一氧化氮(nitric oxide, NO)有效地调节着心血管、呼吸及神经系统的生理功能. NO也积极参与免疫反应，促进巨噬细胞抗击外来病原体. 作为重要的生物信使分子，NO可在细胞和组织中快速扩散，进而与目标物发生反应[1]. 基于此，探测NO是一项十分有意义的工作，发展一种高效的NO探测方法也引起了相关学者广泛的研究兴趣.

相比采用传统的电化学法、紫外-可见光谱法、电子自旋共振波谱法等方法探测NO[2]，荧光法探测NO具有显著的优势，因为荧光法具有操作简单、灵敏度高、实时性等优点[3]. 文献研究[4]表明：现有的绝大多数NO荧光探针采用单一荧光的变化来探测NO. 在实际的NO探测中，探针体系的荧光强度易受其自身浓度及探测环境的干扰(如溶剂、pH、温度、离子强度等因素)，进而影响了单一荧光探测NO的准确性和可行性. 当探针体系中引入参比荧光，与原有荧光构建出比率型荧光强度来测定NO，可避免探针自身浓度及探测环境的干扰. 鉴于采用了比率荧光强度的方式，这将显著提高NO探测的准确性和可行性. 在先前的文献报道中，BARKER等构建了基于细胞色素与有机染料的复合物，用于比率荧光测定巨噬细胞内外的NO[5]；SOH等报道了荧光胺标记金属有机化合物与染料的复合物用于比率荧光探测NO[6]；YUAN等[7]和YU等[8]发展了两个不同有机染料分子的结合物用于比率荧光传感NO.

相比有机荧光染料，胶体半导体量子点(quantum dots, QDs)具有成本低、制备简单、荧光稳定性好、荧光量子产率高、激发光谱宽、发射波长和尺寸可调等诸多显著优点[9-10]. 在生物医疗领域应用较多的量子点材料是CdSe纳米粒子,但它对生物组织的毒化作用令其应用受到限制. 对于CdSe量子点的毒性问题，目前最有效的方法是用无毒材料对量子点进行包覆[11]. 由于SiO2层对生物体无毒副作用，能有效避免生物有机体与剧毒的量子点材料直接接触，并能保护量子点表面不被氧气所氧化变质，增强了量子点的稳定性. 因此实验采用SiO2对CdSe量子点进行包覆，以阻止其对生物体的毒害.

为了克服上述现有技术存在的不足,本文提供了一种双量子点纳米复合物一氧化氮比率荧光探针的合成方法. 该方法具有操作简单、成本较低、稳定性好、可行性高等特点，在纳米科学、生物医药及化学分析等技术领域将有良好应用前景.

1实验部分

1.1试剂与仪器

3-巯基丙酸、CdSe量子点、CdTe量子点，阿拉丁试剂；十六烷基三甲基溴化铵、原硅酸四乙酯、3-氨基丙基三乙氧基硅烷，国药试剂；一氧化氮气体，青岛爱若气体化工有限公司；其他为常用分析纯试剂.

RF5000 型荧光分光光度仪，日本Shimadzu 公司; 昆山舒美超声波清洗器KQ3200，昆山超声仪器有限公司；79-1磁力搅拌器，江苏省金坛市环宇科学仪器厂；TDL-5A台式低速大容量离心机，金坛市华城海纳仪器厂.

1.2双量子点纳米复合物NO比率荧光探针的合成

双量子点纳米复合物NO比率荧光探针采用商品化巯基丙酸稳定的CdSe量子点和CdTe量子点为起始原料，该荧光探针的合成方法可简单以图1表示.

图1　双量子点纳米复合物NO比率荧光探针的合成方法示意图Fig.1　Sythesis of the double quantum dots nanocomposite ratiometric fluorescent sensor for NO

1.2.1CdSe@SiO2复合物的合成

选取商品化巯基丙酸稳定的CdSe量子点，最大发射波长为532 nm，配置成质量浓度为2 g/L的水分散液. 取5 mL CdSe量子点水分散液与0.1 g十六烷基三甲基溴化铵添加至“50 mL乙醇+1 mL蒸馏水+1 mL氨水+0.2 mL原硅酸四乙酯”的前驱体溶液中，在超声波作用下分散10 min，然后在室温和磁力搅拌下反应2 h. 最后通过离心处理得到CdSe@SiO2复合物，壳层厚度控制约为5 nm. 该复合物可直接用于下一步反应.

1.2.2CdSe@SiO2-NH2核壳复合物的合成

将CdSe@SiO2复合物分散在“50 mL乙醇+0.1 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷”混合液中，在室温下磁力搅拌反应6 h，制得CdSe@SiO2-NH2核壳复合物，配置成质量浓度为2 g/L备用.

1.2.3CdSe@SiO2-CdTe纳米复合物的合成

选取商品化巯基丙酸稳定的CdTe量子点，最大发射波长为603 nm，配置质量浓度为1 g/L的水分散液. 在缓慢磁力搅拌下，将该水分散液逐滴加至2 g/L的CdSe@SiO2-NH2核壳复合物水分散液中，制得1 g/L的CdSe@SiO2-CdTe纳米复合物，即NO比率荧光探针.

2结果与讨论

2.1 检测机理

一氧化氮(NO)与CdTe量子点表面Cd离子结合会形成Cd-NO复合物，引起CdTe量子点荧光猝灭，而不影响CdSe量子点的荧光. 由于CdSe量子点最大发射波长在500～550 nm之间，而CdTe量子点最大发射波长在600～650 nm之间，因此可选定532 nm与603 nm为CdSe@SiO2-CdTe复合物的荧光检测波长. 以CdSe量子点的荧光作为参比，构建CdTe与CdSe双量子点的比率荧光强度与NO浓度之间的线性关系，通过观察荧光比率变化来间接反映一氧化氮的浓度变化. 进而构建出基于CdSe@SiO2-CdTe的NO比率荧光探针.

2.2NO浓度变化对荧光光谱的影响

向1 g/L的CdSe@SiO2-CdTe纳米复合物体系中通入NO，体系内NO浓度梯度为0.1～2.2 μmol/L，选取NO浓度值数量为10个，测定体系的荧光发射光谱,并记录不同浓度下I603/I532比值，如图2所示. 由图2可以看出，随着NO浓度逐渐升高，该纳米复合物在532 nm处的荧光强度(即ICdSe)基本不变，而其在603 nm处的荧光强度(即ICdTe)逐渐降低. 表明CdSe@SiO2-CdTe纳米复合物的外层量子点的荧光会被NO猝灭，而内层量子点的荧光不受影响，因而基于该双量子点的NO比率荧光探针构建成功. 将不同NO浓度下该纳米复合物在532 nm和603 nm处的荧光强度的比值I603/I532绘图后拟合，可以得到一条直线，即随着NO浓度的变化，I603/I532与NO浓度呈线性关系(R=-0.995 4). 因此CdSe@SiO2-CdTe纳米复合物可以用于探测NO的存在及浓度变化.

图2　不同NO浓度下CdSe@SiO2-CdTe纳米复合物荧光发射光谱及对ICdTe/ICdSe即I603/I532值的影响Fig.2　Effects of emission spectra and I603/I532 values with different NO concentrations

3结论与展望

采用简易的静电自组装方法构建出双量子点纳米复合物，并以SiO2包覆其表面，能有效避免生物有机体与剧毒的量子点材料直接接触，并能保护量子点表面不被氧化变质，增强了量子点的稳定性. 依据外层量子点的荧光会被NO猝灭，而内层量子点的荧光不受影响，进而构建出基于该双量子点的NO比率荧光探针. 与现有的技术相比，本发明方法简单、成本较低、荧光稳定性好，引入了比率荧光强度，可显著提高NO探测的准确性和可行性，从而准确定位NO的释放部位以及释放速度. 在接下来的研究中，我们将根据本复合物已有特性，通过探索NO与纳米复合物的结合方式，达到NO缓释释放，获得最佳治疗效果. 另外，还可以在此复合物上添加靶向基团，以期获得缓释释放与靶向治疗的双重作用. 此外，由于CdSe量子点具有一定毒性，限制了其应用，下一步可寻找低毒、成本低、制备简单、荧光稳定性好、荧光量子产率高的量子点进行替换. 本研究对于发展高质量的NO探针具有一定的参考价值.

参考文献：

[1] 张灯青, 赵圣印, 刘海雄. 一氧化氮荧光分子探针[J]. 化学进展, 2008, 20(9): 1396-1405.

[2] 张娴, 王红, 梁淑彩, 等. 检测生理内源性一氧化氮分子探针的研究及应用进展[J]. 分析科学学报, 2002, 18(6): 513-517.

[3] 孙俊永, 黄克靖, 刘彦明. 分子荧光探针在一氧化氮分析中的应用进展[J]. 信阳师范学院学报(自然科学版), 2008, 21(1): 155-160.

[4] TIAN L, DAI Z C, LIU X L, et al. Ratiometric time-gated luminescence probe for nitric oxide based on an apoferritin-assembled lanthanide complex-rhodamine luminescence resonance energy transfer system [J]. Anal Chem, 2015, 87: 10878-10885.

[5] BARKER S L R, CLARK H A, SWALLEN S F, et al. Ratiometric and fluorescence-lifetime-based biosensors incorporating cytochromec′ and the detection of extra-and intracellular macrophage nitric oxide [J]. Anal Chem, 1999, 71: 1767-1772.

[6] SOH N, IMATO T, KAWAMURA K, et al. Ratiometric direct detection of nitric oxide based on a novel signal-switching mechanism [J]. Chem Commun, 2002: 2650-2651.

[7] YUAN L, LIN W Y, XIE Y N, et al. Development of a ratiometric fluorescent sensor for ratiometric imaging of endogenously produced nitric oxide in macrophage cells [J]. Chem Commun, 2011, 47: 9372-9374.

[8] YU H B, JIN L J, DAI Y, et al. From a BODIPY-rhodamine scaffold to a ratiometric fluorescent probe for nitric oxide [J]. New J Chem, 2013, 37: 1688-1691.

[9] TAN L, WAN A, LI H, et al. Novel quantum dots-carboxymethyl chitosan nanocomposite nitric oxide donors capable of detecting release of nitric oxide in situ [J]. Acta Biomater, 2012, 8: 3744-3753.

[10] TAN L, WAN A, LI H, et al. Quantum dots-poly(N-isopropylacrylamide) hybrid nanogel diazeniumdiolates as donors and real-time probes of nitric oxide [J]. Mater Chem Phys, 2013, 138: 956-962.

[11] 谢飞, 廖宇峰, 李文江, 等. CdSe/ZnS/SiO2多层核壳结构量子点材料的制备[J]. 稀有金属材料与工程, 2014, 43(S1): 235-238.

[责任编辑：吴文鹏]

HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

Abstract: A new organic-inorganic complicated vanadoborate [H2en]4[V6B20O50H8(H2O)]·en·8 H2O (1) (en = ethylenediamine) was obtained via hydrothermal technique and characterized by IR spectrometry, thermogravimetric analysis and single crystal X-ray diffraction. Its structure comprises one [V6B20O50H8(H2O)]8-polyoxoanion, four protonated [H2en]2+cations, a free en molecule and eight water molecules. The most interesting characteristic that the sandwich-type [V6B20O50H8(H2O)]8-polyoxoanion was built by two triangle {B10O26} clusters in the staggered fashion anchoring a hexagonal {V6O18} cluster via twelve μ3-O atoms. During the course of integrating with the hexagonal {V6O18} cluster, two triangle {B10O26} clusters were rotated with 45°.

Keywords: polyoxometalate; vanadoborate; hydrothermal technique

CLC number： O614.3 Document code： A

Article ID： 1008-1011(2016)03-0299-08

收稿日期：2016-01-22.

基金项目：山东省高等学校科技发展计划项目(J14LM02)，济南大学研究生创新基金项目(YCXS15020).

作者简介：李娜(1990-)，女，硕士生，研究方向为药物化学. *通讯联系人： E-mail： mls_sunj@ujn.edu.cn.

中图分类号：O62

文献标志码：A

文章编号：1008-1011(2016)03-0291-03

Synthesis and application of double quantum dots nanocomposite ratiometric fluorescent sensor for NO

LI Na1,2, SUN Jie1,2*, WANG Xiaojing1,2, SUN Jingyong1,2,WANG Bing1,2

(1.SchoolofMedicineandLifeSciences,UniversityofJinan-ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,Shandong,China; 2.InstituteofMateriaMedica,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,Shandong,China)

Abstract:A double quantum dots nanocomposite of CdSe@SiO2-CdTe was synthesized based on the electrostatic adsorption. A Cd-NO complex was formed by the combination of nitric oxide (NO) with Cd ions on the surface of CdTe quantum dots, which led to CdTe quantum dots fluorescence quenching, without affecting the fluorescence of CdSe quantum dots. Furthermore, its utility was carried out to detect NO quantitatively according to the linear relationship between the concentrations of NO (0.1～2.2 μmol/L) and the relevant I603/I532values of the ratiometric fluorescent sensor．

Keywords:NO; ratiometric fluorescence; double quantum dots nanocomposite; CdSe@SiO2-CdTe

An organic-inorganic complicated vanadoborate [enH2]4[V6B20O50H8(H2O)]·en·8H2O

LI Hailou, SUN Longhui, LIU Yajie, CHEN Lijuan*

(HenanKeyLabratoryofPolyoxometalateChemsitry,CollegeofChemistryandChemicalEngineering,