tuftsin及其衍生物T肽的抗癌作用研究进展

安映红，袁守军

(1.空军总医院临床检验中心生化室，北京　100142；2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理毒理室，北京　100850)



tuftsin及其衍生物T肽的抗癌作用研究进展

安映红1,2，袁守军2

(1.空军总医院临床检验中心生化室，北京100142；2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理毒理室，北京100850)

摘要：tuftsin是机体脾脏产生的一段生理活性肽，其基本功能是刺激巨噬细胞和粒细胞，提高促吞噬的能力；其对肿瘤细胞并没有直接杀伤效应，但可以通过增强效应细胞的细胞毒功能杀伤肿瘤细胞，在抗感染和抗肿瘤方面具有不可替代的作用。但由于其肽链短、易被水解的特性，至今难以成药而应用于临床。tuftsin的系列衍生物以及与其他药物联用却可提高其抗癌活性，具有广阔的研究前景；尤其是衍生物T肽具有明显的抗肿瘤作用，其作用机制基本明确，可望成为新型抗肿瘤生物反应调节剂。

关键词：tuftsin； T肽；生物抗癌；中性粒细胞；巨噬细胞；生物反应调节剂

tuftsin是1970年Najja和Nishioka研究淋巴细胞激肽的生物功能时发现的一段生理活性肽，由脾脏产生，结构为苏-赖-脯-精氨酸(Thr-Lys-Pro-Arg，TKPR)[1-2]。陆续的研究证明该肽具有天然的促吞噬作用，能够促进天然免疫细胞：巨噬细胞和中性粒细胞的趋化、游走、吞噬和细胞毒作用，发挥明显的抗肿瘤、抗病毒活性，具有独特的靶向天然免疫细胞的调节功能[1]。然而由于其较短的肽链及体内半衰期使得其至今难以成药并应用于临床。因此多种拟tuftsin衍生物被研发以期解决这一难题，也一度成为研究的热点。本文主要对tuftsin的生物特点、衍生物研究进展进行综述，并重点阐述tuftsin衍生物之一，T肽在术后残瘤模型中的应用价值。

1体内tuftsin的生物活性特点

tuftsin的分子质量为500.59，是免疫球蛋白IgG的Fc段在脾脏降解产生的四肽，其作用方式较为广泛[1,2]。tuftsin最基本的功能就是促吞噬和调节免疫功能[1]，可促进中性粒细胞、枯否细胞的增殖及吞噬作用，刺激白细胞胞饮、迁移；明显增强巨噬细胞对病毒微生物的作用[1]。tuftsin还可促进炎性细胞因子释放及体内再分布[3]。在升高血压、情绪调节、提高智力、抗焦虑、止痛及加快神经移植后修复方面，tuftsin都有一定的作用，尤其在抗肿瘤方面有较强活性，如：对L1210白血病具有明显的免疫抗癌活性[4]。血清的tuftsin水平可以反映脾脏的免疫功能，从而间接反映肿瘤患者或者有腹腔脏器疾患的机体免疫状况，其低血清浓度与严重的感染发生高度相关[5]。脾功能损害的病人血清tuftsin水平会下降并导致中性粒细胞的活性降低，增加感染发生率[5]；对狗或人切除了脾脏后，会造成白细胞吞噬活性明显降低[6]。而且，tuftsin以及其衍生物还能影响一些细胞因子，如TNF和IL-10、IL-17等[7-8]的表达；tuftsin还是免疫球蛋白来源的新型生物活性肽，在调节免疫反应中具有重要的作用。tuftsin的这些生物功能的发挥是通过特异性地结合到细胞表面受体实现的。巨噬细胞、中性粒细胞等细胞表面都有tuftsin受体特殊的结合位点。1989年，Moore等[9]鉴定出tuftsin的一个能与神经降压肽(neurotensin)结合的受体位点。2006年,Mathew等[10]研究发现，神经菌毛素(neuropilin 1,NRP-1)也为tuftsin的受体之一，他们认为tuftsin与NRP-1结合，影响TGF-β信号通路；tuftsin还可与VEGF165竞争性结合NRP-1，从而阻断VEGF165与其受体的结合，阻止肿瘤血管生成[10]。

2tuftsin 及其衍生物的应用

tuftsin 的广泛生物学作用激起研究者对其生物学应用不断开发的兴趣。但在二期临床研究中发现静脉给药tuftsin对早期恶性肿瘤病人的治疗作用非常有限[11]。不过与化疗药联合使用效果明显，如对非小细胞肺癌的治疗[12]，以及使头颈部肿瘤术后NK细胞的活性恢复[13]等。实际上，由于tuftsin的肽链非常短，导致在体内的半衰期很短，进入机体后由于蛋白酶水解，难以发挥生物学作用。近十几年来tuftsin的单独应用研究已经非常少见。通常研究者以tuftsin结构为基础，合成一些衍生物来进行研究，在抗微生物感染、抗病毒及抗肿瘤应用上取得过较好的研究结果。在抗微生物感染方面，Smith 等[14]将庆大霉素与tuftsin连接用于治疗铜绿假单胞菌引起角膜炎，有良好的效果。

tuftsin衍生物还可抗寄生虫感染，如Thr-Lys-Pro-Arg-NH-(CH2)2-NHCOC15H31能够治疗疟原虫感染的小鼠[15]；tuftsin与米替福新连接，可增强米替福新对内脏利士曼原虫的疗效[16]；tuftsin与制霉菌素脂质体连用具有治疗患白细胞减少BALB/C小鼠的新型隐球菌感染[17]。在制备疫苗方面，研究者将分支状流感病毒M2e与tuftsin连接成多肽疫苗能更好地刺激机体免疫反应[18]。Fridkin等[19]将3′-叠氮基-3L脱氧胸苷(AZT)连接到HIV感染的巨噬细胞上，在其表面形成AZT与tuftsin的结合，具有治疗AIDS的潜力。抗肿瘤方面也有多种应用，如使用抗独特型抗体(anti-idiotypic antibodies,Ab2) ,与tuftsin连接后形成的融合蛋白能模拟CA125的功能，对患宫颈癌的小鼠免疫功能产生保护作用[20]。

但几乎所有的tuftsin相关的研究均没有后续更深层次的探讨。TP(T peptide)是近年来研究较为深入的一个tuftsin的新型衍生物，大量实验证据表明TP具有明显、广泛的抗癌活性[21-24],并能够调节细胞的免疫抑制状态[25]。下述着重介绍TP近年来的研究应用。

3tuftsin 衍生物TP的抗癌研究

基于tuftsin肽链短，难以成药的特点，本研究团队对tuftsin短肽进行修饰，以分子质量小，免疫原性弱的赖氨酸为核心，合成了新结构的tufsin分支肽(synthetic tuftsin branched polypeptide,TP)。TP拥有4个tuftsin样结构(Fig 1)，体内药物代谢研究表明，该结构在体内半衰期约2～4 h[26]，与原tuftsin四肽相比(T1/2=2.8 h)[27]明显增加了对水解酶的抵抗能力。体外实验研究表明,TP明显增强巨噬细胞对肿瘤细胞杀伤活性，并且对多种肿瘤细胞具有较强的杀伤力，如小鼠恶性黑色素瘤细胞B16-F10及人肺癌细胞A549[24]。TP还能促进小鼠巨噬细胞Ana-1细胞大量分泌TNF-α和 NO，而且给予TP的小鼠外周血中TNF-α和 NO 的含量也明显升高，TNF-α的含量为92.45±0.12，是正常对照组的1.67倍，模型对照的1.47倍；NO的含量为85.99±4.4，是正常对照组的2.54倍，未手术模型对照的2.20倍，手术模型对照的1.45倍[24]。这些数据充分说明，TP能明显增强机体免疫力并提高机体免疫系统对抗肿瘤的能力。但是这个新结构的药物应用于动物体内时，使用常规的动物移植瘤模型，却并未体现出良好的药效[23-24]。那么，为什么TP在体外能增强巨噬细胞的促吞噬、细胞毒活性，却不能在体内杀死实体肿瘤细胞，值得研究者进一步思考。

Fig 1　TP structure：Four tuftsin peptides are connected via a flexible linker lysine

临床中所见的肿瘤大多数为实体瘤，实体瘤具有抗原性弱，抗原递呈功能降低，并释放大量免疫抑制因子，致使机体免疫功能低下，免疫漏逸等的特点，手术切除是目前治疗实体瘤的首选模式。 但外科手术实际上仅仅能切除肉眼可见的肿瘤原发灶或转移灶，一些微小病灶及显微镜可见的易播散的癌细胞却很难被发现。而且手术过程中还能激发大量不良因子产生，刺激癌细胞入血，从而发生远端转移。在荷S180小鼠肉瘤的异种移植瘤模型中，可以观察到手术后残瘤迅猛生长，生长速度超过未手术组10倍以上[24]，盲目采取手术切除肿瘤，很可能加快肿瘤的转移和复发。手术切除了大部分的实体瘤，减轻肿瘤负荷。但是接下来，用以防止肿瘤复发为目的的辅助治疗，要克服的最重要的难题是如何选择性的杀死残余癌细胞而不破坏健康的正常细胞。手术后的放化疗在清除了大部分肿瘤病灶的同时，也导致机体的免疫机能进一步恶化，往往伴随免疫细胞数量、质量大大下降，甚至产生免疫抑制。调节机体免疫状态，控制或者延缓术后癌症患者的复发，可成为临床癌症治疗的重要模式。

因此，依据当前术后肿瘤的治疗模式，本研究团队认为：将TP应用于术后提高机体免疫力，预防癌症复发的层面上可能会有较好的效果。而理想的动物肿瘤模型应该能模拟并真实地反映人类肿瘤自然发生、发展的过程，体现与之有相同病理、生理的特征。因此，通过大批动物实验摸索建立了动物术后残瘤模型。应用该模型，研究团队发现TP对S180肉瘤、H22肝癌腹水瘤、Lewis肺癌、B16-BL6黑色素瘤等4种鼠源移植瘤以及HT-29结肠癌、HepG2肝癌、MCF-7乳腺癌、BGC-823胃癌等4种人源移植瘤手术后的残瘤生长具有明显的抑制作用，最高抑制率可达到80%；对于免疫缺陷小鼠的残瘤生长抑制率稍有下降但也能达到50%左右。可见对于这种免疫增强类药物，要想使免疫细胞能发挥出看得见的明显作用，特殊的动物模型设计非常重要，而且肿瘤微环境可能是TP在残瘤机体发挥作用的关键原因。中晚期的癌症患者机体免疫力是受到深度抑制的，肿瘤块内的微环境为肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等提供保护作用，肿瘤细胞在不断逃脱机体的免疫监视而存活并不断生长最终形成实体瘤。因此，此时无论用药物怎样刺激免疫细胞都可能无法让免疫细胞接近、有效识别肿瘤细胞并剿灭肿瘤细胞。而手术后的残瘤微环境中肿瘤细胞、免疫细胞暴露，微环境外活化的免疫细胞就有机会直接接触肿瘤细胞，从而产生吞噬或细胞毒作用。本课题组又使用现已应用于临床的胸腺肽做了类似的实验，结果也验证了上述结论，但效果远不及TP[25]。所以残瘤模型的建立可以说为一大类增强免疫功能的药物提供了一种新的评价模型，有助于更多此类药物的研发。

4TP的抗癌作用机制研究

正常小鼠免疫系统功能包括：获得性免疫功能，执行者如T淋巴细胞和B淋巴细胞等；天然免疫功能，执行者如NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等。TP不仅可以明显抑制小鼠移植瘤术后残瘤的生长，而且对免疫缺陷的小鼠，如裸鼠、SCID和NOD-SCID也有较明显的抑制率，抑制作用虽有所下降但仍能保持50%左右的抑制率，可见天然免疫系统在TP抗癌过程中发挥主要的作用。

tuftsin的基本功能是促吞噬，主要效应细胞是天然免疫细胞：巨噬细胞(macrophages， MΦ)和中性粒细胞(neutrophils，Nc)[1-2]。在抗肿瘤免疫调节过程中巨噬细胞是一群重要细胞，可直接或者通过递呈肿瘤相关抗原诱导机体免疫应答杀伤肿瘤细胞。肿瘤间质中存在的肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages，TAM)在肿瘤微环境的调控下可以变换表型，演变为抑制肿瘤生长的M1型和促进肿瘤进程的M2型。研究发现，TP可结合巨噬细胞表面特异性抗体，激活 NF-κB 信号通路，增强巨噬细胞的吞噬、细胞毒功能，同时介导巨噬细胞向 M1 型极化，促使分泌 Th1 相关的促炎因子，如 TNF-α、IL-12、NO、IFN-α/β以及趋化因子CXCL9、CXCL11 等[24-25]。TP还可逆转 M2 巨噬细胞的表型，促使 Th1 相关炎性细胞因子表达增加。体外 IL-4 诱导的Ana-1 巨噬细胞M2 巨噬细胞代表基因 Arg-1表达下调，M1 巨噬细胞代表基因 iNOS、IL-12转录水平和蛋白水平表达上调，明显 M2 极型被扭转[24-25]。可见调节巨噬细胞通路是TP发挥抗癌作用的机制之一。

后续又研究了TP调节另一个重要的靶细胞——中性粒细胞的功能所发挥抗癌作用。中性粒细胞作为非特异性免疫细胞的作用越来越受到科学界的重视。不只是与炎症相关，如丝氨酸蛋白酶等参与炎症反应[28]，而在肿瘤生物学中也起重要作用，类似于巨噬细胞的调节作用。陆续的研究证明，TP也能调节肿瘤相关中性粒细胞(tumor associated neotrophils，TAN)向抑制肿瘤生长的表型N1型极化。而对tuftsin类衍生物能够通过这两大类天然免疫细胞发挥抗癌作用的研究国内国外还都没有过报道。

综上所述，研究者们通过大量的实验研究证明，TP通过诱导机体外周的未被活化的巨噬细胞或中性粒细胞发生抑制肿瘤生成的表型极化，释放杀伤性细胞因子，增强细胞毒功能，在残瘤微环境中发挥明显抗癌效应，由此来改变机体的整体免疫状态，增强对抗癌症的能力。

对于TP抗癌药效及作用机制的研究，不仅奠定了TP新药物申报的基础，也为进一步研发同类免疫增强药物提供可供借鉴的动物模型及方法。

5展望

肿瘤就是在不断的逃脱机体免疫系统的监视而形成的，提高机体的免疫力可成为预防癌症发生及复发的最有效方法。目前肿瘤的免疫治疗方法多样，如过继免疫疗法(adoptive immunotheray)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killers，CIK)等，但疗效有限，副作用很大，那么最安全有效的方法还应该能寻找到直接有效的提高癌症患者的自体免疫力药物，不需要繁杂的体外培养，不需要移植。现有的证据表明，免疫细胞杀死癌细胞的数量可能需要超过癌细胞一个数量级以上，因此对于中、晚期恶性肿瘤病人，肿瘤负荷达到几百克至上千克，肿瘤细胞数量达到数十万亿计，用免疫细胞杀死如此众多的癌细胞是不太可能的。在手术之后，使用一些药物直接活化体内的免疫细胞，并用于治疗残余肿瘤，预防残余肿瘤复发，延长生存期比较现实可行，TP等类药物也许是最具这种辅助治疗潜力的免疫治疗药物。但tuftsin类衍生物(如TP)能够进入临床试验还需要对其分子机制进行更深层次的研究。

(致谢：本综述中所介绍到的实验均在军事医学科学院放射医学研究所肿瘤药理研究室完成。感谢李琳娜、王珊珊、杨德宣、郭万军、宣自学等人的协助。)

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Research progress on anti-cancer effects of tuftsin and its derivatives

AN Ying-hong1，2,YUAN Shou-jun2

(1.CenterforClinicalLaboratory,AirForceGeneralHospital,PLA,Beijing100850,China;2.DeptofPharmacologyandToxicology,BeijingInstituteofRadiationMedicine,Beijing100850,China)

Abstract:tuftsin, a physiologically active peptide, can promote phagocytosis, basically stimulates the macrophages or neutrophils and improve their phagocytotic function. tuftsin can not directly kill tumor cells. Due to its short structure and the characteristics of being susceptible to hydrolysis, it is difficult for tuftsin to be made into medicine and applied clinically. However, derivatives of tuftsin-series and combination of tuftsin with other drugs can greatly enhance the cytotoxic effect on tumor cells of tuftsin. It has a broad prospect of research, especially derivative-TP has a significant anti-tumor effect. Its mechanism is clear and its is expected to become a new type of anti-tumor biological response regulator.

Key words:tuftsin；T peptide；biological anticancer； neutrophils,；macrophages；biological response modifier(BRM)

收稿日期:2016-01-06,修回日期:2016-02-14

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No 30973564); 国家科技部“重大新药创制”科技重大专项综合新药研究开发技术大平台项目(No 2012ZX09301003-001)

作者简介：安映红(1980-)，女，博士，主治医师，研究方向：肿瘤药理学，Tel:010-66928545,E-mail:rainning_sky@163.com；

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.002

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2016)06-0747-04

中国图书分类号：R-05；R341.6；R730.5；R977.6

网络出版时间：2016-5-25 15:39网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.004.html

◇讲座与综述◇

袁守军(1962-)，男，博士，研究员，博士生导师，研究方向：肿瘤药理学，通讯作者，E-mail:yuansj@nic.bmi.ac.cn