利福平对小鼠的肝毒性及胆酸代谢基因的影响

徐永吉,李文楷,刘　杰,陆远富

(遵义医学院基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州 遵义　563000)



利福平对小鼠的肝毒性及胆酸代谢基因的影响

徐永吉,李文楷,刘杰,陆远富

(遵义医学院基础药理省部共建教育部重点实验室，贵州 遵义563000)

摘要：目的观察利福平长期给药引起小鼠的肝损伤及其对胆汁酸代谢通路相关基因的影响。方法1 d 1次灌胃给予♂昆明种小鼠180 mg·kg-1利福平连续30 d与90 mg·kg-1利福平连续90 d；麻醉取血、肝脏，称肝重，检测血清谷丙转氨酶(ALT)，观察肝脏组织的病理变化；提取肝脏总RNA并采用RT-PCR法检测胆汁酸代谢相关基因mRNA的表达情况，提取肝脏总蛋白并采用Western blot 法检测相关蛋白的表达。结果连续给予利福平180 mg·kg-130 d和90 mg·kg-190 d，小鼠肝重系数增加，肝脏发生明显病理改变，表现为肝细胞水肿、羽毛样变性与脂肪变性，且利福平180 mg·kg-130 d病理改变较严重；连续给药180 mg·kg-1利福平30 d可使胆酸代谢基因胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)、法尼醇受体(FXR)、小分子异源二聚体伴侣(SHP)表达增加，胆盐输出泵(BSEP)的表达降低；连续给药90 mg·kg-1利福平90 d，仅可发现胆酸代谢基因胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)表达增加。结论利福平对小鼠具有明显肝毒性，引起胆汁淤积性肝损伤；其影响CYP7A1与BSEP的基因表达可能是其导致胆汁淤积性肝损伤的机制之一。

关键词：利福平;肝毒性;胆酸代谢;胆汁淤积;CYP7A1;BSEP

利福平(rifampicin,RFP)做为目前预防和治疗结核病的一线药物，在临床上常与异烟肼合用以增强疗效。正常剂量短期服用利福平其肝毒性较小，而长期或大剂量则具有明显的肝毒性，利福平引起的肝损害是由于与蛋白结合、药物的肝肠循环延长、竞争性抑制胆红素的排泄、引起肝细胞紧密连接蛋白被破坏、肝内胆汁淤积[1]，导致黄疽和肝细胞的坏死，但其分子机制未见有文献明确的阐述。本文通过给予小鼠180 mg·kg-130 d与90 mg·kg-190 d的利福平，观察利福平的肝毒性，并且检测其对肝脏胆汁酸代谢通路上相关基因的影响。

1材料与方法

1.1药品与仪器

利福平胶囊(成都锦华，批号：131006)；ALT测定试剂盒(南京建成，批号：20140615)；TRIzol(大连宝生物公司)；逆转录试剂盒(Applied Biosystems公司)；SYBR Green预混液(美国BIO-RAD公司)；实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司，型号：CFX connect)；多功能梯度PCR仪(德国Eppendoff)；ChemiDoc XRS化学发光成像系统(美国BIO-RAD公司)；CYP7A1抗体(abcam公司，ab65596，兔多克隆抗体)；BSEP抗体(abcam公司，ab112494，兔多克隆抗体)；Thermo Bis-Tris凝胶等。

1.2实验动物与分组

健康♂昆明种小鼠，体质量18～22 g，由重庆市第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，于遵义医学院基础药理学实验室SPF级动物房饲养(许可证号：SYXK黔2014-003)；自由进食、饮水，适应性喂养1周后开始给药，每天灌胃给药1次：设利福平180 mg·kg-1组,连续给药30 d；利福平90 mg·kg-1组，连续给药90 d；对照组给予相应体积的蒸馏水。

1.3动物给药及取材

小鼠按分组灌胃给药0.1 mL·10 g-1；分别给药30 d与90 d，末次给药后1 h麻醉，收集血清和肝脏组织。

1.4Real time PCR检测基因表达

检测肝组织中CYP7A1、FXR、SHP和BSEP mRNA的表达：肝组织100 mg采用TRIzol提取总RNA，通过紫外分光光度计检测总RNA的浓度与质量，以260/280的比值(1.8～2.0)确认RNA质量后再用于下一步实验：调整总RNA浓度为100 mg·L-1进行逆转录(37℃，15 min；85℃，5 sec)，所得cDNA 进行SYBR Green PCR反应(退火温度60℃)，PCR反应以β-actin作为内参照，所用特异性引物如Tab 1；结果采用相对定量法进行分析。

Tab 1　Primer sequences used for RT-PCR reaction

1.5Western blot检测蛋白表达

取100 mg肝组织，加入1 mL RIPA裂解液与PMSF，匀浆后离心取上清，经BCA蛋白定量试剂盒定量蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液95℃变性。10% Bis-Tris凝胶进行电泳，使用PVDF膜进行蛋白转膜，经封闭后，4℃孵育一抗过夜，TBST缓冲液洗膜后孵育二抗1 h，洗膜滴加化学发光液曝光显影。

1.6数据统计分析

2实验结果

2.1利福平对小鼠肝重系数的影响

如Fig 1所示，小鼠30 d连续给予180 mg·kg-1利福平与90 d给予90 mg·kg-1利福平，给药组组肝重系数明显增加。

Fig 1　The liver index of rifampicin 180 mg·kg-1for 30 days and 90 mg·kg-1for 90 days

2.2利福平对小鼠ALT的影响

如Fig 2所示，小鼠连续给予利福平180 mg·kg-130 d后，利福平组血清谷丙转氨酶(ALT)明显增加；而连续给予利福平90 mg·kg-190 d，血清ALT含量虽有增加，但增加不多。

2.3连续给予利福平180 mg·kg-130 d肝脏病理切片

与空白组相比，肝脏细胞明显病变损伤，表现为肝细胞水肿、羽毛样变性与脂肪变性。见Fig 3。

Fig 2　The level of ALT by rifampicin 180 mg·kg-1for 30 days and 90 mg·kg-1for 90 days in serum.

Fig 3　Photomicrography of liver sections from the mice in the Rifampicin 180 mg·kg-1for 30 days group

Histopathology showed dramatically steatosis and spotted feathery-like degeneration.↑ feathery-like degeneration.A:Control(original magnification×100);B:Control(original magnification×200);C:Rifampicin(original magnification×100);D:Rifarmpicin(original magnification×200)

2.4连续给予利福平90 mg·kg-190 d肝脏病理切片

与空白组相比，利福平组有明显肝细胞病理学改变：可见细胞肿涨，羽毛样变性；可发现其病理改变较利福平180 mg·kg-130 d组轻。见Fig 4。

2.5利福平180 mg·kg-130 d肝脏中胆酸代谢相关基因CYP7A1、FXR、SHP和BSEP mRNA的表达

与空白组相比，利福平180 mg·kg-130 d组CYP7A1、FXR与SHP均呈现基因高表达现象，BSEP呈现低表达，见Fig 5。Western blot检测蛋白表达也证实CYP7A1表达增加，BSEP表达降低。见Fig 6。

2.6正常剂量利福平90 d肝脏中胆酸代谢相关基因CYP7A1、FXR、SHP和BSEP mRNA的表达

与空白组相比，利福平90 mg·kg-190 d组CYP7A1基因呈高表达，FXR、SHP与BSEP未出现明显变化，见Fig 7。Western blot检测蛋白表达也证实CYP7A1表达增加，BSEP表达无改变。见Fig 8。

3讨论

抗结核药物引起的肝损害是药物性肝损害最常见的原因之一，一线抗结核药物利福平最常见的不良反应为肝毒性[2]；利福平可导致以胆汁淤积为主的肝损伤[3]，利福平作为肝药酶强诱导剂之一，与其他具有一定肝毒性的药物合用，可使发生致命性肝毒性的危险明显增加[4]。

Fig 4　Photomicrography of liver sections from the mice in the Rifampicin 90 mg·kg-190 days group

Histopathology showed steatosis and spotted feathery-like degeneration.↑ feathery-like degeneration.A:Control(original magnification×100);B:Control(original magnification×200);C:Rifampicin(original magnification×100);D:Rifarmpicin(original magnification×200)

Fig 5　The relative expression of CYP7A1, FXR, SHP and BSEP mRNA in the mice liver of rifampicin 180 mg·kg-130 days group

Fig 6　Protein expression of CYP7A1 and BSEP in the mice liver of rifampicin 180 mg·kg-130 days group

Fig 7　The relative expression of CYP7A1, FXR, SHP and BSEP mRNA in the mice liver of rifampicin 90 mg·kg-190 days group

结核病人一般需服用利福平半年以上，成人口服剂量为10～20 mg·kg-1：10 mg·kg-1为长期服用正常剂量，20 mg·kg-1为短时间大剂量给药。根据人与小鼠给药剂量体表面积换算法，本实验中设利福平180 mg·kg-130 d组与90 mg·kg-190 d组。

Fig 8　Protein expression of CYP7A1 and BSEP in the mice liver of rifampicin 90 mg·kg-190 days group

本实验中，小鼠口服利福平180 mg·kg-130 d，小鼠生理状态较差，皮毛黯淡无光，肝指数增加，血清ALT水平明显增高，肝细胞水肿、羽毛样变性，提示肝细胞胆汁淤积[5]，证实利福平180 mg·kg-130 d具有肝毒性。服用90 mg·kg-1利福平90 d后，其肝重系数亦增加，血清ALT水平虽有增加但仍在正常范围，肝组织病理切片发现90 d 90 mg·kg-1利福平亦可引起肝细胞内胆汁淤积状病理改变。长期服用利福平，会引起小鼠胆汁淤积性肝损伤，但90 mg·kg-190 d利福平损伤较小，可能与其长期服药肝损伤自适应有关[6]。

胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)是肝细胞合成胆汁酸经典途径唯一的限速酶[7]，CYP7A1的活性与胆汁酸的疏水程度呈明显负相关，而疏水性胆汁酸的肝内聚积是胆汁淤积性肝病肝损伤的主要原因；CYP7A1 基因位点上具有多个受体结合位点, 多种核受体参与了针对 CYP7A1 基因结合位点的调控, 其中包括法尼醇受体(FXR)与小分子异源二聚体伴侣(SHP)；FXR 是一个孤儿核受体,研究发现：内源性胆酸可以激活 FXR，因此FXR也称为胆汁酸受体。SHP的表达可抑制胆汁酸合成相关基因及SHP自身的表达[8]，SHP表达的增加还会减少胆汁酸被肝细胞再摄取[9]。FXR与胆酸结合后被激活，激活的FXR通过与SHP的反应元件单位结合，抑制其他核受体，进而抑制胆汁酸合成关键酶CYP7A1的表达，减少胆汁酸合成。

检测各组肝脏组织胆汁酸代谢相关基因表达情况，发现连续给予利福平180 mg·kg-130 d与90 mg·kg-190 d均可增加CYP7A1 mRNA表达，且180 mg·kg-130 d引起CYP7A1 mRNA表达增加更明显，检测蛋白表达情况也证实此现象；CYP7A1表达增加会引起肝细胞内胆汁酸合成增加，疏水性胆汁酸的肝内聚积，肝细胞内胆汁酸池过大则会引起机体肝脏的负反馈调节FXR/SHP 通路被激活，本实验也证实：FXR、SHP的mRNA表达增加。而连续给药90 mg·kg-190 d，FXR、SHP的mRNA表达未见明显变化，提示机体肝脏的FXR/SHP 负反馈调节通路未被激活。BSEP是肝细胞毛细胆管膜上重要的胆汁酸排泄载体[10]。可依赖ATP将胆汁酸通过肝细胞的小管膜分泌至胆汁中。抑制BSEP是药物性肝损伤的机制之一[11]，其对利福平所致的肝损伤具有重要影响[12-13]。利福平180 mg·kg-130 d后可明显降低BSEP表达，90 mg·kg-190利福平未引起BSEP表达变化，提示180 mg·kg-1利福平给药30 d可引起BSEP介导的胆汁酸排泄减少。

小鼠口服利福平180 mg·kg-130 d与90 mg·kg-190 d均引起肝细胞合成胆汁酸经典途径的限速酶CYP7A1表达增加，引起胆汁淤积性肝损伤；180 mg·kg-130 d利福平还会引起胆汁酸排泄主要载体BSEP的表达降低，使肝损伤明显加重。

综上所述，利福平对小鼠具有明显的肝毒性，会引起的胆汁淤积性肝损伤；且其毒性与剂量的关系比给药时间的长短更为明显。利福平会引起胆汁代谢相关基因CYP7A1、BSEP的基因表达变化，可能是其导致胆汁淤积性肝损伤的机制之一。研究利福平引起的肝损伤机制将有助于减少利福平应用过程中的不良反应并为治疗不良反应提供依据[14-15]。

(致谢：本实验在陆远富教授与刘杰教授指导下，由徐永吉和李文楷完成。实验完成于贵州省遵义医学院基础药理省部共建教育部重点实验室；感谢实验室各位老师的支持与帮助；感谢王洋硕士研究生在实验过程中的帮助；感谢国家自然科学基金(81460632)的资助。)

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Effects of rifampicin on hepatotoxicity and genes related to bile acid metabolism in mice

XU Yong-ji, LI Wen-kai, LIU Jie, LU Yuan-fu

(KeyLabofBasicPharmacologyofMinistryofEducation,ZunyiMedicalCollege，ZunyiGuizhou563000，China)

Abstract：AimTo examine liver damage by rifampicin and hepatic gene expression related to bile acid metabolism in mice.MethodsAdult male mice were given rifampicin(180 mg·kg-1, po) daily for 30 days and(90 mg·kg-1, po) daily for 90 days, blood biochemistry, histopathology, and gene expression were examined.ResultsRifampicin increased animal liver index and serum enzyme activities. Histopathology showed steatosis and spotted feathery-like degeneration. Rifampicin increased the expression of CYP7A1 after 30 and 90 days of administration, along with increased FXR and SHP. Rifampicin reduced the expression of BSEP after 30 days of high dose administration.ConclusionRepeated administration of rifampicin may cause liver injury and intrahepatic cholestasis in mice, and these effects are associated with the alteration of gene expression related to bile acid metabolism.

Key words:rifampicin; hepatotoxicity; bile acid metabolism; cholestasis ; CYP7A1; BSEP

收稿日期：2016-01-22，修回日期：2016-04-01

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81460632)

作者简介：徐永吉(1990-)，男，硕士生，研究方向：药代动力学与药物毒理学，E-mail：408968436@qq.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.020

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2016)06-0841-05

中国图书分类号：Q-485；R-332；R-333.4；R-961

网络出版时间：2016-5-25 15:39网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.040.html

陆远富(1971-)，男，博士，教授，硕士生导师,研究方向：药物代谢与毒理学,通讯作者，E-mail： yflu@zmc.edu.cn