胃肠安丸中主要成分厚朴酚及和厚朴酚的药代动力学研究

陈钰玲 王淑萍 王磊 金兆祥 张静泽 陈虹 高文远

[摘要]采用HPLCMS/MS多反应监测（MRM）定量分析，以布洛芬为内标物在负离子模式条件下建立血样中厚朴酚及和厚朴酚药物浓度的测定方法，探讨不同剂量胃肠安丸口服给药后木脂素类成分的药代动力学过程，为进一步揭示胃肠安丸抗腹泻作用的物质基础提供理论依据。血浆样品中厚朴酚、和厚朴酚分别在525～1 34400，1008～2 58000 μg·L-1线性关系良好；精密度、稳定性及提取回收率实验结果表明，该类成分血药浓度的测定方法稳定可靠。口服给药后所测成分血药浓度均随给药剂量的增加而增大，木脂素类成分Tmax为055～142 h，厚朴酚、和厚朴酚Cmax分别可达到99636～2 33096，18987～1 46943 μg·L-1。胃肠安丸口服给药后木脂素类成分入血吸收速度较快，为证明胃肠安丸口服给药后抗腹泻作用起效快、疗效持久提供实验依据。

[关键词]胃肠安丸；厚朴酚；和厚朴酚；药代动力学

[Abstract]To conduct multiplereaction monitoring（MRM） quantitative analysis with highperformance liquid chromatography coupled with mass spectrometry method， establish the quantification method of magnolol and honokiol in blood sample under negative ion mode with ibuprofen as internal standard， investigate the pharmacokinetic process of lignans constituents after oral administration of Weichang′an pill（WCA） at different doses， and provide theoretical basis to further reveal the material basis of WCA′s antidiarrhea effect In the plasma samples， the linear relationship was good over the concentration range of 525 to 1 34400 μg·L-1 for magnolol and 1008 to 2 58000 μg·L-1 for honokiol The results of precision， stability， and extraction recovery tests showed that the determination method of plasma concentration for such compositions was stable and reliable Dosedependence was shown for magnolol and honokiol in the plasma concentrationtime profile The results indicated that the time to reach the maximum plasma concentration（Tmax） for lignanoids was 055142 h， when the maximum plasma concentration（Cmax） could reach 996362 33096，189871 46943 μg·L-1 respectively for magnolol and honokiol The lignanoids could be absorbed rapidly in the blood after oral administration of WAC pills， providing experimental basis to prove rapid and longacting antidiarrhea effect of WAC pills after oral administration

[Key words]Weichang′an pill； magnolol； honokiol； pharmacokinetics

doi：10.4268/cjcmm20160926

中藥胃肠安丸为天津乐仁堂制药厂于20世纪80年代，在“十香丹”基础上研制开发的治疗胃肠道疾病的纯中药制剂。该方具有芳香化浊、理气止痛、健胃导滞的功效，临床用于治疗湿浊中阻、食滞不化所致的腹泻、腹痛、消化不良、肠炎、痢疾等，疗效显著[1]。前期研究表明胃肠安丸甲醇提取物对正常小鼠胃肠运动具有促进作用，而对新斯的明所致腹泻小鼠胃肠运动具有抑制作用，由此证明胃肠安丸甲醇提取物对肠平滑肌运动具有双向调节作用[2]；量效关系研究结果显示随给药剂量增加其抗腹泻作用增强[3]，对新斯的明所致肠运动功能亢进小鼠，胃肠安丸甲醇提取物给药剂量为08 g·kg-1时对其抑制作用最强[3]。中药复方活性成分种类繁多，经分析胃肠安丸中主要成分包括来自君药木香中的倍半萜类、臣药厚朴中的木脂素类、枳壳中的黄酮苷类以及佐使药大黄中的蒽醌类化合物，经测定此类化合物的质量分数总和在胃肠安丸中达到16 mg·g-1，其中木脂素类成分厚朴酚及和厚朴酚所占比例最高[4]，且药典中将厚朴酚及和厚朴酚作为指标成分用于中药胃肠安丸质量控制，规定厚朴酚及和厚朴酚总量不得低于3 mg·g-1。

前期已对采用固相萃取处理样品、HPLCMS/MS多反应监测（MRM）定量分析的方法对胃肠丸大鼠口服给药后倍半萜类化合物的体内药代动力学过程进行了研究[5]，而对于胃肠安丸中重要活性成分及指标性成分的厚朴酚及和厚朴酚体内药代动力学过程尚未进行研究。厚朴酚及和厚朴酚具有重要的药理活性，如抗抑郁、抑制癌细胞转移、抗血小板聚集、抗炎抗氧化，并对脑缺血具有保护作用[67]。此外厚朴酚通过阻断Ca2+内流起到舒张气管的作用，能够抑制5HT诱导的肠平滑肌收缩。研究表明，厚朴酚对平滑肌的调节作用与Ca2+通道有关，并作用于胆碱能受体及5HT受体，可能为M3和/或5HT4[89]。本研究采用HPLCMS对不同剂量胃肠安丸提取物口服给药后厚朴酚及和厚朴酚体内代谢过程进行研究，不仅能够科学指导临床用药，亦为进一步研究中药胃肠安丸作用物质基础提供依据。

1材料

Agilent 1200液相色谱串联质谱联用仪（双高压泵、自动进样器、柱温箱、电喷雾离子化接口、三重四极杆质谱检测器、色谱工作站，Agilent Chem Station）；Anke TGL 16G 高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；XW 80A 涡旋仪（海门市其林贝尔仪器）；微量分析天平（CP225D，Sartourius Co）。

厚朴酚、和厚朴酚、布洛芬均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为112655201203，112653201219，102019201092，纯度分别为995%，998%，990%；乙腈、甲醇为色谱纯，盐酸、甲酸为化学纯，均购于天津康克德试剂有限公司。

Wistar大鼠，雄性，体重（250±20） g，由中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号SCXK（军）20120004号。在20～22 ℃，光照/黑暗12 h/12 h条件下饲养，自由饮食、饮水，适应性饲养1周后开始实验。

2方法与结果

21LCMS/MS分析

色谱条件：Agilent C18色谱柱（46 mm×150 mm，5 μm）；流动相甲醇（A）05%甲酸水（B），梯度洗脱，0～20 min，65%～85%A；柱温35 ℃；流速05 mL·min-1；进样体积10 μL。

质谱条件：Agilent 6410三重四级质谱仪，离子源为ESI源；负离子模式检测，电喷雾离子化负离子MRM检测（ESI-），毛细管电压350 kV，脱溶剂温度为350 ℃，脱溶剂气500 L/hr，反吹气40 L/hr，检测电压为25 V，碰撞能分别采用和厚朴酚24 eV，厚朴酚27 eV。用于定量分析的离子反应厚朴酚以及和厚朴酚均在负离子模式下出现m/z 265[M-H]-的准分子离子峰，厚朴酚质谱中可见m/z 247的碎片离子，其为碎片离子[M-H-H2O]-；而在和厚朴酚质谱中可见m/z 224的碎片离子，其为碎片离子[M-H-CH2=CH-CH2]-。

22对照溶液制备

221内标溶液制备精密称取布洛芬（图1）对照品适量，用甲醇溶解并稀释成每毫升含有1776 μg的溶液。

222对照品溶液制备分别精密称取和厚朴酚以及厚朴酚（图1）适量，溶于甲醇中，配成质量浓度分别为和厚朴酚8078 μg·L-1，厚朴酚10904 μg·L-1的对照储备液。将此混合液按照一定比例进行稀释得到对照溶液质量浓度分别为厚朴酚525，1050，21，42，84，168，336，672，1 344 μg·L-1，和厚朴酚1008，2016，4031，8063，16125，32250，645，1 290，2 580 μg·L-1。

23給药样品制备

胃肠安丸粉碎后称取100 g，加入10倍量甲醇回流提取2次，每次1 h，合并2次提取液，回收溶剂得到胃肠安丸提取物样品，按照药典规定方法测定胃肠安丸中厚朴酚514 mg·g-1，和厚朴酚514 mg·g-1，所得样品4 ℃保存备用。

24血浆样品前处理

取大鼠血浆100 μL，加入10 μL内标溶液（1776 μg·L-1）混合均匀，离心后加入C18固相萃取小柱中，以2 mL去离子水洗去杂质，再加入甲醇1 mL洗脱，收集甲醇流出液于45 ℃ 氮气流下吹干。残留物加50 μL流动相溶解，12 000 r·min-1离心5 min，取10 μL进样，按上述LCMS进样分析。

25血浆样品标准曲线制备

分别精密量取大鼠空白血浆100 μL，加入不同浓度混合对照溶液10 μL，按24项下操作处理血浆样品后进行分析，分别记录血样中厚朴酚及和厚朴酚的峰面积，以血浆样品中对照品与内标物浓度比值为横坐标，对照品与内标物峰面积比值为纵坐标，进行回归计算，求得标准曲线方程。

26方法学考察

261方法特异性为避免内源性杂质干扰，选择提取回收率高，检测灵敏的实验方法，因此对不同血样处理方法进行比较，包括甲醇或乙腈沉淀法、液液萃取法及固相萃取小柱处理。实验结果表明，采用固相萃取小柱处理的样品杂质干扰少，提取回收率高，优于其他处理方法。采用Wistar大鼠6只，经适应喂养后，实验前12 h禁食，自由饮水。每只大鼠由眼眶静脉丛取血约1 mL，肝素抗凝，12 000 r·min-1离心5 min，分离空白血浆，备用。分别取大鼠空白血浆100 μL，在不加内标物的情况下，空白血浆均按照24项下对样品进行提取处理，考察大鼠体内内源性干扰成分是否会对检测带来影响。实验结果显示，所测定血样中厚朴酚、和厚朴酚以及内标物布洛芬在实验检测条件下的保留时间分别为1113，770，736 min，可知在待测物质相对应保留时间下血浆中未见有内源性杂质干扰。

厚朴酚及和厚朴酚为中药厚朴中木脂素类成分，此类成分仅在负离子模式下响应。厚朴酚及和厚朴酚亦为同分异构体，由于厚朴酚结构中4OH与4′OH易形成分子内氢键，使和厚朴酚极性大于厚朴酚。保留时间上和厚朴酚先于厚朴酚被洗脱出来；质谱裂解也存在差异，厚朴酚以及和厚朴酚均在负离子模式下出现m/z 265[M-H]-的准分子离子峰，厚朴酚质谱中可见m/z 247的碎片离子，其为碎片离子[M-H-H2O]-；而在和厚朴酚质谱中可见m/z 224的碎片离子，其为碎片离子[M-H-CH2=CH-CH2]-（图2）。

262标准曲线方程的确定及定量限配制一系列浓度的血浆样品溶液并进行倍比稀释，按照24项下方法进行操作，在实验条件下进行LCMS分析。通过记录色谱峰面积计算标准曲线方程、最低检测限及最低定量限。采用实验检测方法对9个不同浓度样品进行连续3 d测定，其灵敏度及准确度均能满足检测要求，大鼠血浆中厚朴酚及和厚朴酚在525～1 34400，1008～2 58000 μg·L-1线性关系良好，R2大于099。所测定成分准确度满足最低浓度RSD小于20%，其他浓度RSD小于15%的检测要求，标准曲线测定结果显示，其灵敏度和准确度均满足实验要求（表1）。

263精密度与准确度取大鼠空白血浆100 μL，

A厚朴酚m/z 265→247；B和厚朴酚m/z 265→224；C布洛芬m/z 205→161。

图2厚朴酚及和厚朴酚对照品以及内标物质谱图

Fig2MS spectrum of magnolol，honokiol and IS ibuprofen配制高、中、低3个浓度的质控样品（质量浓度分别为厚朴酚1050， 84， 672 μg·L-1及和厚朴酚2016， 16125， 645 μg·L-1），每个浓度样品平行6份样本，按照24项下方法提取样品进行分析，每个样品进样3次，连续进样3 d，并根据当天所测得的标准曲线方程计算QC样品的浓度，根据QC样品的测定结果计算日内精密度与日间精密度，并计算准确度（RE，准确度=C实测值/C理论值×100%）。

在高、中、低3个浓度下，厚朴酚及和厚朴酚的大鼠血浆样品日内、日间精密度与准确度显示，厚朴酚及和厚朴酚的日间与日内精密度与准确度表明，所采用的提取方法准确可靠，重复性良好（表2）。

264稳定性血浆样品经过冷冻（-20 ℃）存放3 d，3次冷冻融化（室温）循环放置，室温放置24 h进行处理。取大鼠空白血浆02 mL，配制高、中、低3个浓度的质控样品（质量浓度分别为厚朴酚1050，8400，67200 μg·L-1；和厚朴酚2016， 16125， 64500 μg·L-1），每个浓度平行3份样本，按照24项下方法提取样品进行分析，实验条件下厚朴酚及和厚朴酚的测定结果稳定可靠（表3）。

265回收率取大鼠空白血浆100 μL，配制高、中、低3个浓度的质控样品（质量浓度分别为厚朴酚1050， 84， 672 μg·L-1，和厚朴酚2016， 16125， 645 μg·L-1），每个浓度平行3份样本，按照24项下方法提取样品进行分析，测定峰面积

A，同时测定未经提取处理相同标示浓度对照品的峰面积，两者的比值即为相对回收率。厚朴酚及和厚朴酚在高、中、低3个浓度下的绝对回收率为7623%～8257%，内标物质的回收率8804%，表示所采取的血浆样品提取方法可行（表4）。基质效应考察结果显示，本方法提取的血浆样品可以忽略内源性物质的干扰。

表4血样中厚朴酚及和厚朴酚测定的提取物回收率（±s，n=3）

Table 4Extract recovery of magnolol and honokiol in rat plasma（±s，n=3）

成分质量浓度/μg·L-1提取回收率/%基质效应/%厚朴酚10508623±2719011±418848607±2079109±1516728472±5769401±211和厚朴酚20168019±3019181±158161258191±2089367±2276458471±3339053±376266给药及血样采集与数据处理大鼠禁食12 h（自由饮水），灌胃分别给予胃肠安丸提取物04，08，16 g·kg1，分别于给药前和给药后0083， 033， 067， 133， 2， 3， 4， 6， 8， 10， 12， 24， 36， 48 h由眼眶静脉丛取血约250 μL，肝素抗凝，12 000 r·min-1离心5 min，分离约200 μL血浆，置于-20 ℃冰箱冷冻保存至测定。大鼠灌服胃肠安丸提取物后，在不同的采血时间点取样，按照所建立的测定方法测定厚朴酚及和厚朴酚的血药浓度，将所得数据经过3P97软件进行药代动力学模型拟合，计算药代动力学参数。实验结果（图3）和药代动力学参数（表5）显示，胃腸安丸口服给药后厚朴酚及和厚朴酚口服吸收较为迅速，1 h左右此类成分即达到血药浓度的最高值，口服16 g·kg-1给药剂量时厚朴酚及和厚朴酚的Cmax分别为（1 46943±56955），（2 33092±62934） μg·L-1。

3讨论

厚朴酚及和厚朴酚为中药厚朴中的主要木脂素类成分，既是活性成分又是质量控制的指标成分。厚朴酚及和厚朴酚为中药胃肠安丸中的主要指标成分，且在该方抗腹泻作用中发挥重要作用，前期工作中，作者采用LCMS以地西泮为内标物，在正离子表5胃肠安丸口服给药后厚朴酚及和厚朴酚药代动力学参数（±s，n=6）

模式条件下测定了大鼠口服给予胃肠安丸后倍半萜内酯类化合物木香烃内酯以及去氢木香内酯体内代谢过程，此类成分对离体平滑肌表现为较强的抑制作用[10]，而此成分在体内吸收较为缓慢，木香烃内酯血药浓度达峰时间在10 h，而去氢木香内酯在12 h。对平滑肌亦起到舒张作用的厚朴酚及和厚朴酚，虽然关于体内药代动力学研究的报道较多，但是胃肠安丸口服给药后此类成分的体内代谢过程尚不清楚。

文献报道采用HPLC[11]，毛细管电泳[12]及HPLCMS[13]等对厚朴药材及复方给药后厚朴酚及和厚朴酚的体内药代动力学过程进行研究。厚朴单味药材口服给药后厚朴酚及和厚朴酚在胃肠道吸收较差，生物利用度低，约半数剂量的药物经胃肠道直接排出体外。故口服给药后和厚朴酚会因血药浓度低而无法得到完整的药时曲线，厚朴提取物 245 mg·kg-1口服给药后和厚朴酚仅在20，30，45 min的血样中能够检出，而相同剂量的直肠给药避免了肝脏首过效应的影响，因此给药后和厚朴酚的血药浓度增加了6倍，厚朴酚血药浓度增加了2倍。剂量为厚朴酚60 mg·kg-1，和厚朴酚20 mg·kg-1的厚朴提取物口服给药后最大血药浓度为974，522 μg·L-1[14]。本研究胃肠安丸分别采用3个剂量口服给药，最高给药剂量折算为厚朴酚816 mg·kg-1，和厚朴酚476 mg·kg-1，口服给药后的吸收程度均有较大提高，最大血药浓度厚朴酚1 469，2 330 μg·L-1；亦高于厚朴提取物直肠给药剂量所达到的血药浓度。由此证明中药复方配伍后显著促进了厚朴酚及和厚朴酚的体内吸收。

中藥之间相互作用关系逐渐成为热点，不仅为临床用药提供科学安全的指导，也为中医探讨药材之间的配伍关系提供科学合理的解释。与不同中药配伍可能对其成分的代谢过程产生影响，以泻心汤为例，比较了大黄与黄芩、大黄与黄连配伍对大黄中蒽醌类成分代谢的影响，发现大黄黄芩配伍后Cmax，AUC高于单独灌服大黄煎剂，而大黄黄连配伍后Cmax，AUC均明显降低，由此说明大黄与黄芩会促进大黄中蒽醌类成分的入血吸收而大黄与黄连配伍则对该类成分的吸收产生抑制作用。由此说明复方制剂中中药之间配伍关系的不同对于活性成分药代动力学的影响较大[15]。本研究中厚朴酚及和厚朴酚与文献报道相比，血药浓度的增加与中药配伍促进其入血吸收有关，比较厚朴及厚朴三物汤口服给药后和厚朴酚的血药浓度后所得结果显示，厚朴、大黄、枳实3味药的配伍促进了和厚朴酚的入血吸收[16]。而胃肠安丸组方中含有大黄与枳壳，因此其血药浓度的改变与组方药味的配伍密切相关，不仅如此，其厚朴酚及和厚朴酚本身亦是P450酶的抑制剂[17]，药味配伍后在受其他成分影响的同时，也会导致其他中药中活性成分体内代谢过程的改变，因此尚需通过中药配伍药代动力学研究对厚朴酚及和厚朴酚入血吸收的促进作用进行深入研究。

本研究建立了LCMS测定胃肠安丸口服给药后大鼠血浆中厚朴酚及和厚朴酚体内药代动力学的过程。在血浆样品中厚朴酚及和厚朴酚在525～1 344，1008～2 580 μg·L-1线性关系良好，且精密度、稳定性及提取回收率结果表明，以布洛芬为内标物，在负离子模式下测定厚朴酚及和厚朴酚血药浓度的实验方法稳定可靠。3种剂量胃肠安丸提取物口服给药后厚朴酚及和厚朴酚的血药浓度随给药剂量的增加而增大，Tmax为055～142 h， Cmax分别为99636～2 33092，18987～1 46943 μg·L-1。

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[责任编辑曹阳阳]