葡萄糖分子印迹电极测定唾液中葡萄糖

申 远，蔡正浩，王 川，弓晓杰

（1.大连大学 人才建设办公室，辽宁 大连 116622；2.大连大学 环境与化学工程学院，辽宁 大连 116622；3.大连大学 医学院，辽宁 大连 116622）

葡萄糖分子印迹电极测定唾液中葡萄糖

申 远1，蔡正浩2，王 川2，弓晓杰3

（1.大连大学 人才建设办公室，辽宁 大连 116622；2.大连大学 环境与化学工程学院，辽宁 大连 116622；3.大连大学 医学院，辽宁 大连 116622）

采用分子印迹技术、邻苯二胺为功能单体，通过循环伏安法对该电极进行性能考察。结果表明，该分子印迹电极对葡萄糖具有较好的灵敏度与选择性，线性范围为1×10-9~1×10-8mol/L，检出限(S/N=3)为1×10-9mol/L。将电极用于实际样品的分析，方法回收率为96.3%~100.9%，RSD为0.15%~4.4%。测定了多个口腔唾液样本中葡萄糖的含量，检测结果均在8.37~12.68 mg/L范围内。由此认为，该电极可以直接用于检测人体口腔唾液葡萄糖含量，实现对人体中血糖水平无创性检测。

唾液；葡萄糖；分子印迹；循环伏安法

分子印迹技术源于超分子化学，是利用特定的模板分子为印迹分子，制备对目标分子具有特殊印迹识别功能的聚合物[1]。葡萄糖（Glu）是生物体中新陈代谢不可缺少的能量物质，其在生物体内发生氧化还原反应时所放出的热量是生物体生命活动的直接能量来源[2]。糖尿病这种“不治之症”给人类健康和生活带来了极大的影响[3]。唾液葡萄糖含量被证明与人体血糖指标存在有相关性，有研究表明正常人体唾液葡萄糖为4~12.5 mg/L[4]。目前葡萄糖的检测方法有碘量法，化学发光法，高效液相色谱法，酶电极法等[5-7]。近年来，基于化学修饰电极的电化分析方法在医学领域、生物分析、药物分析领域发展迅速。但是，修饰电极膜的稳定性和选择性等性能亟待提高[8]。分子印迹膜因为具有高的稳定性和特异性识别功能，可以弥补电化学修饰电极在电化学分析中特异性不足的问题[9,10]。

本工作使用的功能单体是邻苯二胺(POPD)，模板分子是葡萄糖(Glu)，甲基丙烯酸(Methyl acrylic acid)为交联剂，在玻碳电极表面电聚合成聚邻苯二胺(POPD)膜，在超声条件下洗脱Glu模板分子并对实验条件进行优化，制备具有良好选择性的葡萄糖分子印迹电极。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

电化学工作站CS300型(武汉科思特公司)；玻碳电极(GCE，φ=3 mm)，饱和Ag/AgCl电极(天津艾达恒晟公司)，对电极为铂丝电极；QT-2060型数控超声波清洗器(天津瑞普公司)；普希科P4－036型笔式酸度计(乐清大仓电子公司)。

葡萄糖(天津市凯信化学工业有限公司分析纯AR），邻苯二胺（Aladdin，AR 98%)，甲基丙烯酸(国药集团化学试剂有限公司化学纯CP)，自制0.1 mol/L pH=7.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠（PBS）缓冲溶液，二次蒸馏去离子水作为实验用水。

1.2 玻碳电极的活化

将GCE在麂皮上先使用1.0 um的Al2O3粉末抛光后在使用0.3 um的Al2O3粉末二次抛光至镜面光滑，依次用二次蒸馏水、0.1 mol/L H2SO4扫描至循环伏安曲线稳定、无水乙醇和二次蒸馏水在超声清洗器中清洗5 min。将清洗后的电极置于K3［Fe(CN)6］(5 mmol/L)探针分子溶液中循环伏安扫描，直到获得合适的循环伏安（CV）曲线。将活化好的电极保存存在二次蒸馏去离子水以备下次使用。

1.3 分子印迹电极的制备

将活化好的GCE置于含由0.1 mol/L pH=7.0PBS缓冲溶液新制的含有1.0 mmol/L OPD与10 mmol/L Glu溶液中，采用循环伏安法(设置电位范围为-1～1 V，扫速为100 mV/s)，循环扫描15圈，即在洁净的GCE表面聚合形成一层POPD膜。将聚合后的电极(Glu/POPD/GCE)放入体积分数比为6:4的甲醇/乙酸混合洗脱液中，在超声清洗器中超声8 min洗脱Glu模板分子，得到Glu的分子印迹电极(Glu/MIP/GCE)。

1.4 试验方法

三电极系统装置为：工作电极(MIP/GCE)，参比电极(饱和Ag/AgCl电极)，对电极(铂丝电极)。将MIP/GCE置于5 mmol/L K3[Fe(CN)6］探针分子溶液中，采用循环伏安(CV)法，扫速为100 mV/s。

2 结果与讨论

2.1 分子印迹敏感膜的制备与性质

聚合过程的CV曲线如图1所示。由图可见OPD的电聚合是一个不可逆过程。随着扫描圈数的增加、在GCE表面的POPD聚合膜的厚度也随之增加，检测到的峰电流却随之降低。这表明POPD聚合膜是一层不导电的绝缘膜。

图1 OPD电聚合过程的CV曲线

如图2所示，探针分子在Glu/POPD/GCE修饰电极表面响应的峰电流明显降低（曲线3），这可能是由于Glu分子中的多个羟基与OPD中的氨基可以相互作用而形成氢键，因此在OPD的电化学聚合过程中，Glu分子被镶嵌到POPD膜中。由于分子印迹膜是一层不导电的绝缘膜，探针分子无法穿过分子印迹膜到达GCE表面进行传质而导致峰电流较低。用体积比为甲醇：乙酸=6:4的溶液在超声清洗器中超声8 min洗脱模板Glu分子后，探针分子在MIP/GCE修饰电极表面检测到的峰电流明显提高（见曲线2）。这表明分子印迹膜上出现了空洞，为探针分子的电子传递提供了通道；由于分子印迹膜的存在，阻碍了探针分子的传质过程，因此裸露的GCE电极上检测到的峰电流值为最大（如曲线1所示）。

图2 不同电极在K3[Fe(CN)6]中的CV曲线

2.2 电极性能的比较

采用CV法对MIP/GCE与GCE的电化学性能做了对比。如图3所示，裸露的玻碳电极GCE（曲线2），在PBS缓冲体系为溶剂的Glu溶液中无电化学响应，而分子印迹电极MIP/GCE在-0.5和-0.3V附近出现了一对氧化还原峰（见曲线1）。这表明Glu溶液在该分子印迹电极表面具有良好的电化学响应性能。这可能是由于分子印迹膜上的模板Glu分子被洗脱后再POPD表面留下的空洞在空间结构上与Glu分子形成互补，并且具有特异性的氢键识别位点。当MIP/GCE放入Glu溶液中时，印迹膜上的空洞与Glu分子匹配性结合而实现印迹识别，进而对 Glu在该电极（MIP/GCE）表面的氧化还原反应产生一定的电化学催化作用、所以峰电流明显提高。

图3 不同电极在Glu溶液中的响应曲线

2.3 电聚合过程条件的影响

2.3.1 聚合圈数的选择

研究了在玻碳电极表面修饰圈数对分子印迹膜性能的影响。如图4所示，在聚合15圈时所制备的分子印迹电极对探针分子的电化学响应为最好。

图4 聚合层数的选择

2.3.2 单体分子与模板分子用量比选择

单体分子与模板分子用量比较小时，单体与模板分子难以充分聚合，而单体用量过多时又会对模板分子产生包埋、不利于洗脱Glu模板分子，并导致峰电流和灵敏度降低。考察了OPD与Glu摩尔浓度之比分别为1∶1，1.5∶1，2∶1，2.5∶1，3∶1条件下的峰电流。结果如图5所示，当用单体与模板分子的摩尔比为1∶1时，峰电流值最大。

图5 模版分子与单体分子比例的选择

2.3.3 缓冲溶液pH选择

缓冲体系的酸碱度对分子印迹膜的性能会产生一定的影响。在酸性条件下POPD易聚合而成，但酸性过大会使膜的稳定性降低会使印迹膜发生分解。采用循环伏安技术、用氰化钾探针探究了不同pH值的缓冲体系对分子印迹膜性能的影响，如图6所示，该缓冲体系的最佳pH值为7.0。

图6 聚合液pH的选择

2.3.4 洗脱条件的选择

如图7所示，K3［Fe(CN)6］响应的峰电流随洗脱时间的增加而提高，当洗脱时间超过8 min时峰电流降低，可能是由于Glu模板分子在8 min前未被完全洗脱，在9 min时分子印迹膜被破坏导致分子印迹膜的性能降低。因此选择最佳的洗脱时间为8 min。

图7 洗脱时间的选择

探究了洗脱液比例对洗脱效果和分子印迹膜性能的影响。如图8所示，当洗脱液组成为甲醇/乙酸=6:4时，洗脱效果最好、Glu溶液在该分子印迹电极表面的峰电流值最大、电化学响应最好。

图8 洗脱液比例的选择

3 分子印迹电极的性能测试

运用CV法测定了该分子印迹电极在不同标准浓度葡萄糖溶液中的电化学响应情况。如图9中MIP/GCE对不同浓度Glu溶液的峰电流变化曲线所示，当浓度在1×10-9~1×10-8mol/L范围内峰电流呈现良好的线性关系，回归方程为Ip（uA）=325.88c（umol/L）+12.352，及Ip（uA）=-315.17c（umol/L）-24.148，线性相关系数分别为0.9691和0.9543，相比之下氧化峰的线性更佳，所以选择氧化峰的回归方程作为工作曲线。其检出限（S/N=3）为1×10-6mol/L，用该印迹电极对2×10-6mol/L的Glu溶液进行了10次测定，RSD值为0.6151%，表明该印迹电极的重现性良好。

图9 MIP/GCE对不同浓度的Glu的CV响应曲线与线性方程

4 样本分析

人体空腹口腔唾液样本葡萄糖的测定。取正常人体早晨8时空腹唾液样品，在干净的离心管中经离心获取上层清夜，用微量进样器取1 uL口腔唾液样本用pH=7.0 PBS稀释定容至10 mL，全部转移至小烧杯中，在前述测试条件下测定其Glu含量并进行回收率实验，结果如表1所示。

表1 回收率实验结果（n=5）

5 结论

以邻苯二胺为功能单体、以体积比为6:4的甲醇/乙酸混合液为模板洗脱液，制备了葡萄糖分子印迹敏感膜电极。该分子印迹电极对葡萄糖具有较好的灵敏度与选择性，线性范围为1×10-9~1×10-8mol/L，氧化峰线性相关系数为0.9691。将电极用于实际样品的分析，其方法回收率为96.3%~100.9%，RSD为0.15%~4.4%。测定的多个口腔唾液样本中的葡萄糖含量为8.37~12.68 mg/L。为此，可以认为该电极能用于直接检测人体口腔唾液中的葡萄糖含量，从而为实现人体无创性血糖检测提供依据。

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Glucose Molecularly Imprinted Electrode Detects Glucose in Saliva

SHEN Yuan1,CAI Zheng-hao2,WANG Chuan2,GONG Xiao-jie3
（1.Talents Construction Office of Dalian University,Dalian 116622,China,2.College of Environment and Chemical Engineering,Dalian University,Dalian 116622,China;3.College of Medicine,Dalian University,Dalian 116622,China）

Molecularly imprinted membrane(OPOD)was prepared by molecular imprinting technique to synthesize poly(o)-benzene two amine molecules on the surface of glassy carbon electrode(GCE)by using the two amines as functional monomers.K3［Fe(CN)6］was used as probe molecule,and the electrode was investigated by cyclic voltammetry.The results showed that the imprinted electrode for Glu with good sensitivity and selectivity,the linear range for 1× 10-9~1× 10-8mol/L,the detection limit(S/N=3)was 1×10-9mol/L,the electrode has good reproducibility and stability.The electrode was used for the analysis of the actual saliva samples.The recovery rate was between 96.3%and 100.9%.Determination of the content of a plurality of different normal human oral salivary Glu detection,and the result is great,all fall within the normal range of detection that the electrode can be used for direct detection of saliva Glu detection,realize of non-invasive detection whether excessive blood sugar.

saliva;Glu;molecularly imprinted;electropolymerization;cyclic voltammograms

O657.15

：A

：1008-2395(2016)06-0054-05

2016-10-08

辽宁省科学技术计划项目（2013204001）。

申远(1982-)，男，助理研究员，研究方向：电分析化学。