红芪多糖对D-半乳糖致衰老小鼠抗免疫衰老作用的研究*

柳春玲，寇　宁，张高林，李磊强，庞大勇，程卫东

(1.兰州市中医医院，甘肃 兰州 730050； 2.兰州大学基础医学院，甘肃 兰州 730000)



·实验研究·

红芪多糖对D-半乳糖致衰老小鼠抗免疫衰老作用的研究*

柳春玲1，寇宁2，张高林2，李磊强2，庞大勇2，程卫东2

(1.兰州市中医医院，甘肃 兰州 730050； 2.兰州大学基础医学院，甘肃 兰州 730000)

摘要目的：研究红芪多糖(hedysamn polysaccharide, HPS)的抗免疫衰老作用。方法：使用清洁级昆明种小鼠，采取D-半乳糖腹腔注射的方法构建亚急性衰老小鼠模型；分为正常对照组，模型对照组，维生素E组和HPS高、中、低剂量组。除正常对照组外，其余各组小鼠连续腹腔注射D-半乳糖(120 μg/g)；正常对照组灌胃生理盐水，维生素E组灌胃维生素E溶液(50 μg/g)，HPS高、中、低剂量组依次灌胃200 ，100，50 μg/g HPS水溶液。观察小鼠胸腺和脾脏指数、T淋巴细胞增殖能力、T淋巴细胞亚群的水平，测定小鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α含量。结果：模型对照组小鼠脏器指数、T淋巴细胞增殖能力、T淋巴细胞亚群测定、血清IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α与正常对照组对比，差别有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，HPS高、中、低剂量组的胸腺指数和脾脏指数、T淋巴细胞的增殖能力，CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞百分比，CD3+CD28+T细胞均升高；HPS高、中、低剂量组小鼠血清细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4水平升高，TNF-α水平降低。HPS高、中、低剂量组间诸指标对比，高、中剂量作用明显。结论： HPS具有一定的抗免疫衰老作用，可通过调节T淋巴细胞作用来延缓衰老，能有效改善亚急性衰老小鼠的细胞免疫和体液免疫功能。

关键词红芪多糖；D-半乳糖；衰老小鼠；抗免疫衰老

伴随着人类平均寿命的延长，人口老龄化问题日益成为深刻的社会和医学问题，与衰老相关的疾病呈逐年上升趋势，寻找能够延缓衰老、减少老年疾病发生的药物和方法，具有非常重要的社会价值。红芪为豆科植物多序岩黄芪(HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.)的干燥根，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿等功效[1]。现代药理研究表明：红芪具有抗自由基、免疫调节、抗肿瘤等作用[2]。有关衰老机制的研究发现：衰老在免疫系统最早出现[3]。本实验通过建立D-半乳糖致衰老小鼠模型[4]，采用常规水提醇沉法[5]制备红芪多糖(hedysamn polysaccharide, HPS)，进一步研究红芪抗免疫衰老的作用机制，以期为红芪在延缓衰老方面的推广使用提供依据。

1材料与方法

1.1动物

清洁级昆明种小鼠60只，体质量18～22g，雌雄各半，由兰州大学实验动物中心提供，许可证号：SKXK(甘)201106-0014。

1.2药品、试剂与仪器

红芪购自甘肃武都。胎牛灭活血清，杭州四季青生物工程材料有限公司产品，批号0908162；EZ-SepTMMOUSEIX淋巴细胞分离液，深圳达科为生物技术有限公司产品，批号DKW33_R0100；MTT(批号20140102418)、ConA(批号201405162161)，均为美国Sigma公司产品；SDS，天津化学试剂一厂产品，批号2014021615；RPMI 1640培养基，恒星生物工程有限公司产品，批号NAC1352；小鼠IL-2(ELISA)检测试剂盒(批号E2020-1506-1)、小鼠IL-4(ELISA)检测试剂盒(批号E2020-1504-2)、小鼠IFN-γ(ELISA)检测试剂盒(批号20140801A)和小鼠TNF-α(ELISA)检测试剂盒(批号E2720-1507-1)，均为深圳达科为生物技术有限公司产品；FITC-抗小鼠CD 3单克隆抗体(批号B172038)、PE/CY5-抗小鼠CD 4单克隆抗体(批号B17682014)、PerCP-抗小鼠CD 8单克隆抗体(批号B15852815)和PE-抗小鼠CD28单克隆抗体(批号B163165)，均为Biolegend公司产品；维生素E软胶囊，青岛双鲸药业有限公司产品，批号20140515；D-半乳糖，上海中泰试剂有限公司产品，批号Z00140730。LxJ-IIB飞鸽牌低速大容量多管离心机，上海安亭科学仪器厂产品；Heto-lyo-lab 3000冷冻干燥机，丹麦heto公司产品；SHE-D循环水式真空泵，河南巩义市予华仪器有限责任公司产品；A06061422超净台，苏州安泰空气技术有限公司产品；CO2培养箱，日本SANYO公司产品；TDL-40B型、TGL-16G型离心机，上海安亭科学仪器厂产品；全自动酶标仪，美国BIO-RAD公司产品；流式细胞仪，美国贝克曼COULTER公司产品。

1.3红芪多糖的提取

精确称取红芪干燥根1 000 g，粉碎，加950 mL/L乙醇，回流脱脂2 h；药渣干燥后加水煎煮3次(煎煮时间分别为2 h、1.5 h、1 h)，合并煎煮液并浓缩；冷却后加入950 mL/L 乙醇，充分混匀，静置，离心得到沉淀。将沉淀溶于蒸馏水中，上清液用Sevage法去除蛋白质，剧烈振荡30 min后静置12 h，离心，经冷冻干燥后得到HPS，4 ℃冰箱保存备用。

1.4动物分组、模型的建立与给药

将60只小鼠适应性饲养1周后按照随机数字表法分为正常对照组，模型对照组，维生素E组和 HPS高、中、低剂量组6组，每组10只，雌雄各半。

各组小鼠灌胃药物剂量均按照体表面积[6]进行换算，得到小鼠所需剂量。成人红芪每日用量9～30 g，根据实验动物药物剂量和红芪多糖提取率3.24%换算，HPS高、中、低剂量组等效剂量(生药量)依次为6，3，1.5 g/(kg·d) 。正常对照组以 9 g/L 生理盐水灌胃 10 μL/g，不行腹腔注射；模型对照组腹腔注射D-半乳糖120 μg/g[7]，灌胃9 g/L生理盐水10 μL/g；维生素E组腹腔注射D-半乳糖120 μg/g，灌胃维生素E溶液50 μg/g； HPS高、中、低3个剂量组腹腔注射D-半乳糖120 μg/g，并依次灌胃红芪多糖水溶液200,100,50 μg/g。连续42 d。

1.5检测指标

1.5.1胸腺指数和脾脏指数

末次给药24 h后，称小鼠体质量，经眼眶取血后处死小鼠，取胸腺、脾脏。精确称量胸腺、脾脏质量，计算胸腺指数和脾脏指数。计算公式如下：

脏器指数=脏器质量(mg)/体质量(g)

1.5.2T淋巴细胞增殖能力和T淋巴细胞亚群

脾淋巴悬液的制备：将小鼠处死后置于750 mL/L的乙醇中浸泡，超净台下在无菌环境下取脾脏;用200目尼龙膜平铺于装有EZ-SepTMMOUSEIX淋巴细胞分离液的无菌培养皿上，将摘取的脾脏放置于尼龙膜上，使用适中力度进行研磨，分离并提取淋巴细胞；将含有脾细胞的淋巴细胞分离液移至离心管，加入200 μL 1640完全培养液，离心后吸出淋巴细胞，再次加入10 mL 1640培养液经吹打混匀，再次离心弃去上清，加入1640完全培养液，吹打混匀之后计数，调整淋巴细胞悬液浓度为1×107/mL为后续实验准备。

T淋巴细胞增殖能力测定：将制备好的淋巴细胞悬液调整为1×106/mL，加入96孔培养板中；每个样本设8个复孔，其中4孔加ConA(质量分数为5 mg/L)，另外4孔加含胎牛血清的完全RPMI-1640培养液做阴性对照。每孔加淋巴细胞悬液100 μL，在培养箱内37 ℃培养68 h后，取出并加入MTT(最终质量分数为5 g/L)10 μL/孔，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入100 μL 100 g/L SDS，吹打混匀，37 ℃放置过夜，于酶标仪570 nm处测定OD值。按照下列公式计算刺激指数，以代表小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖程度。刺激指数(SI)=实验孔OD值/对照孔OD值

淋巴细胞亚群的测定: 取制备好的淋巴细胞悬液(1×107/mL)，在EP管中加100 μL，共分装2组，每组6管，共12管。第一组每管加FITC-抗小鼠CD3 1 μL、PE/CY5-抗小鼠CD4(用PBS 稀释10倍)3 μL、PE-抗小鼠CD28 2 μL，第二组每管加FITC-抗小鼠CD3 1μL、PerCP-抗小鼠CD8 1.25 μL、PE-抗小鼠CD28 2μL，混合均匀后4 ℃冰箱避光孵育30 min；加PBS洗涤2次，2 500 r/min离心5 min，弃上清，加500 μL PBS，吹打混匀；流式细胞仪检测CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD3+CD28+T淋巴细胞水平。

1.5.3血清IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α

将静脉血自然静置3 h，使血清充分析出，以1 500 r/min 离心10 min，收集血清。用生理盐水将各组血清样本稀释10倍后用酶联免疫吸附试验方法检测血清IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α的含量。具体操作步骤严格按照说明书进行，在酶标仪450 nm波长测定OD值，根据标准品绘制标准曲线，以ng/L为单位，计算其含量。

1.6统计学方法

2结果

2.1各组小鼠胸腺指数和脾脏指数对比

模型对照组的胸腺指数和脾脏指数低于正常对照组，差别有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，HPS高、中剂量组和维生素E组的胸腺指数和脾脏指数提高，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；低剂量组较之差别无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　各组小鼠胸腺指数和脾脏指数对比　　±s

注：与正常对照组对比， **P<0.01；与模型对照组对比，#P<0.05，##P<0.01。

2.2各组小鼠T淋巴细胞增殖能力对比

与正常对照组对比，模型对照组脾淋巴细胞刺激指数下降, 差别有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，HPS高、中剂量组和维生素E组的刺激指数增高，差别均有统计学意义(P<0.01)；低剂量组较之差别无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2　各组小鼠T淋巴细胞增殖能力对比±s

注：与正常对照组对比，**P<0.01；与模型对照组对比，##P<0.01。

2.3各组小鼠T淋巴细胞亚群对比

2.3.1各组小鼠CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T对比

与正常对照组对比，模型对照组CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T淋巴细胞亚群百分比均减少，差别有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，HPS高、中、低剂量组和维生素E组CD3+T、CD3+CD4+T均升高，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与模型对照组对比，HPS高、中剂量组和维生素E组CD3+CD8+T细胞升高，差别有统计学意义(P<0.01)。与低剂量组对比，高剂量组CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞均升高明显，差别有统计学意义(P<0.01)；中剂量组CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞均升高明显，差别有统计学意义(P<0.01)。与HPS中剂量组对比，高剂量组CD3+T、CD3+CD4+T细胞升高，差别有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3各组小鼠CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T对比

组 别剂量/(g·kg-1·d-1)CD3+T/%CD3+CD4+T/%CD3+CD8+T/%正常对照组—63.07±4.0740.98±5.2523.03±5.17模型对照组0.1231.54±2.33**21.40±4.65**11.54±2.98**维生素E组0.0546.02±2.46##36.45±5.67##21.26±4.85##HPS高剂量组0.250.53±3.06##△△*38.17±3.26##△△*22.78±4.64##△△HPS中剂量组0.145.33±4.42##△△33.70±4.84##△△20.36±4.79##△△HPS低剂量组0.0537.67±2.34#27.72±4.31##14.42±2.49

注：与正常对照组对比，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组对比，#P<0.05， ##P<0.01；与HPS低剂量组对比，△△P<0.01；与HPS中剂量组对比，＊P<0.05。

2.3.2各组小鼠CD28分子表达对比

与正常对照组对比，模型对照组CD3+CD28-T细胞升高，CD3+CD28+T细胞降低，差别有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，HPS高剂量组CD3+CD28-T细胞升高， HPS高、中、低剂量组和维生素E组CD3+CD28+T淋巴细胞明显降低，差别均有统计学意义(P<0.01)。与低剂量组对比，HPS高、中剂量组CD3+CD28+T细胞升高，差别有统计学意义(P<0.01)。与HPS中剂量组对比，高剂量组CD3+CD28+T细胞升高，差别有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4　各组小鼠CD28分子表达对比

注：与正常对照组对比，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组对比，#P<0.05，##P<0.01；与HPS低剂量组对比，△△P<0.01；与HPS中剂量组对比，＊P<0.05。

2.4各组小鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α对比

与正常对照组对比，模型对照组血清IL-2、IFN-γ、IL-4降低，TNF-α升高，差别有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，HPS高、中、低剂量组和维生素E组血清IL-2水平升高，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；HPS高、中剂量组和维生素E组血清IFN-γ、IL-4水平升高，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)； HPS高剂量组和维生素E组血清TNF-α水平降低，差别有统计学意义(P<0.01)。与HPS低剂量组对比，高剂量组血清IL-2、IFN-γ、IL-4升高、TNF-α降低，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；中剂量组血清IFN-γ、IL-4水平升高，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与HPS中剂量组对比，高剂量组血清IL-2升高，差别有统计学意义(P<0.01)。见表5。

表5各组小鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α对比

组 别剂量/(g·kg-1·d-1)IL-2IFN-γIL-4TNF-α正常对照组—24.35±3.5397.63±4.0419.28±4.8350.26±2.82模型对照组0.1210.35±2.67**77.21±2.23**13.08±2.28**58.36±3.61**维生素E组0.0520.96±4.01##90.58±2.43##17.99±2.15##53.46±2.36##HPS高剂量组0.221.79±2.75##△△**91.35±2.57##△△18.15±3.76##△△53.74±2.81##△HPS中剂量组0.117.65±3.05##91.61±4.36#△△17.76±2.23##△56.86±4.65HPS低剂量组0.0514.77±3.81#80.23±4.0114.33±0.9257.76±4.76

注：与正常对照组对比，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组对比，#P<0.05，##P<0.01；与HPS低剂量组对比，△P<0.05，△△P<0.01；与HPS中剂量组对比，＊＊P<0.01。

3结果

红芪具有多种活性成分，包括红芪多糖、黄酮、皂苷、氨基酸等。在对红芪的药理作用研究中发现，红芪具有一定的抗癌活性，对心脑血管系统具有保护作用，还能提高体液免疫和细胞免疫能力，具有清除自由基和抗氧化作用等[8]。

本实验结果显示：模型对照组小鼠的脏器指数、T淋巴细胞增殖程度、T细胞亚群水平、血清IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α均与正常对照组存在明显差异，表明亚急性衰老小鼠模型建立。HPS高、中、低剂量组均可提高小鼠胸腺指数和脾脏指数，对衰老动物模型免疫器官萎缩有一定的抑制作用，还可升高T淋巴细胞刺激指数，HPS对亚急性衰老小鼠的T淋巴细胞增殖能力有恢复作用，能够升高T淋巴细胞亚群的百分比， CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD3+、CD28+T细胞升高作用明显，HPS具有一定的抗免疫衰老作用，可通过调节T淋巴细胞作用来延缓衰老。HPS高、中、低剂量组小鼠血清细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α水平均发生不同程度变化。因此，HPS能有效改善亚急性衰老小鼠模型的免疫功能，纠正机体细胞因子的免疫失衡状态。HPS 3个剂量组之间，高、中剂量组作用明显，说明HPS剂量的高低会影响其抗免疫衰老作用，在一定剂量能增强机体细胞免疫和体液免疫应答。

胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，测定脏器指数可粗略估计免疫功能的强弱，对判断是否衰老具有一定的参考价值。研究表明，免疫细胞的增殖及分化都会引起脾脏质量的增加。本实验结果显示，模型对照组小鼠的胸腺指数和脾脏指数明显低于正常对照组。胸腺和脾脏萎缩，反映出机体免疫功能减弱。与模型对照组对比，HPS高、中、低剂量组和维生素E组小鼠的胸腺和脾脏指数不同程度提高，说明红芪多糖对亚急性衰老小鼠的胸腺及脾脏萎缩起到了抑制作用，对老龄小鼠的免疫器官有一定的保护作用，而且在HPS高、中剂量时的保护作用更加显著。

T淋巴细胞体外增殖反应[9]是检测细胞免疫功能的常用方法之一，通过观察实验药物对T淋巴细胞增殖反应的影响来判断其对细胞免疫功能的影响，有较高灵敏度且结果可靠[10]。实验数据表明，模型对照组小鼠的T淋巴细胞增殖反应中刺激指数明显降低，机体对ConA的增殖反应能力下降，是衰老的免疫学特征之一。HPS高、中、低剂量组和维生素E组均不同程度升高了小鼠的T淋巴细胞增殖反应的刺激指数，其中HPS高、中剂量组升高作用明显，说明红芪多糖对亚急性衰老小鼠的T淋巴细胞增殖能力有恢复作用，而且在HPS高、中剂量时的作用较明显。

CD3是T细胞重要的表面抗原，通常以CD3+T细胞亚群代表T淋巴细胞总数。CD3+T细胞水平下降表示成熟T淋巴细胞减少，细胞免疫功能下降。外周血成熟T淋巴细胞又可以分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。辅助性T细胞(Th细胞)通常表达CD4，而细胞毒性T细胞(Tc细胞)表达CD8。Th细胞又分为Th1细胞和Th2细胞亚群，并产生不同的细胞因子。通常Th1细胞和Th2细胞的百分比、INF-γ、IL-4水平应维持平衡。CD4+T和CD8+T在体内免疫应答时既相互协同又相互拮抗，其平衡失调会导致免疫功能紊乱。本实验结果表明，模型对照组与正常对照组相比，CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞降低，说明参与免疫功能的T细胞总数和T细胞亚群减少，而免疫功能的正常发挥是以足够数量的免疫细胞为物质基础的，T细胞及其亚群的减少将会影响到如黏附功能、信号转导等免疫功能，造成老龄个体的免疫功能降低。HPS高、中、低剂量组和维生素E组均使小鼠CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T细胞百分比升高，说明红芪多糖对亚急性衰老小鼠的T淋巴细胞及亚群有升高作用。

CD28分子是T细胞表面重要的共刺激分子， CD28分子表达的缺失是免疫衰老的重要标志之一[11]，随着年龄的增加，CD28分子的表达逐渐下降甚至丧失[12]。CD28表达水平的降低会使T细胞缺乏共刺激信号而失去免疫功能，在无CD28信号时，TCR表现为失活状态。在本实验中，模型对照组CD3+CD28+T细胞明显减少，提示由其介导的免疫功能已经降低。HPS高、中、低剂量组和维生素E组不同程度升高了小鼠CD3+CD28+T细胞百分比，并且在HPS高、中剂量时的作用表现的较为明显。

白细胞介素(IL-1、IL-2、IL-4等)、干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)和转化生长因子β(TGFβ)等是重要的细胞因子，可调节免疫反应。与衰老关系最密切的是IL-2，是参与免疫应答的重要细胞因子[13]。研究表明，老龄小鼠T细胞分泌IL-2含量和活性均比青龄小鼠明显降低[14]。本实验中，模型对照组小鼠IL-2水平明显降低，在HPS作用后，HPS 3个剂量组小鼠IL-2水平均升高，促进了T淋巴细胞分泌IL-2的能力。IL-4是由Th2细胞产生，具有较强的免疫调节作用。本实验中，HPS 3个剂量均能不同程度升高IL-4水平，说明能够增强小鼠的体液免疫。

机体的IL-4和INF-γ通常维持在相对平衡的状态，对小鼠免疫系统的正常功能具有调节作用。本实验中，模型对照组小鼠IFN-γ水平明显降低，在经HPS作用后，HPS 3个剂量组小鼠IFN-γ水平均升高，从而促进Th1细胞的增殖、分化，增强细胞免疫应答的能力。

肿瘤坏死因子为一类能引起肿瘤组织出血坏死的细胞因子，是重要的促炎性细胞因子，在慢性炎症中发挥重要作用。TNF-α可以诱导多种细胞的增殖及凋亡，肿瘤发生和衰老等与其相关，TNF-α与受体结合后能够通过细胞内信号转导引起自由基产生过量，进而加速机体的衰老[15]。本实验中，模型对照组TNF-α升高，在血清中表达有增加的趋势，在衰老过程中可能存在慢性炎症。红芪多糖3个剂量组和维生素E组TNF-α均不同程度下降，减轻了机体的炎症反应，可能对机体衰老的慢性炎症过程有对抗作用。

本实验中，对红芪多糖高、中、低剂量组相关实验数据进行比较后表明， HPS高、中剂量组作用较显著，说明红芪多糖在一定剂量能够纠正机体细胞因子的免疫失衡状态，增强机体细胞免疫和体液免疫应答。

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(编辑陶珠)

文章编号:1001-6910(2016)06-0063-06

中图分类号:R285.5

文献标志码:B

doi:10.3969/j.issn.1001-6910.2016.06.31

通信作者：程卫东，博士，教授，博士生导师，chengweidong888@sina.com

* 基金项目：国家自然科学基金项目(81373806)；甘肃省中医药管理局中医药科学技术研究课题(GZK-2012-43)；甘肃省中医药管理局中医药科学技术研究课题(GZK-2013-18)

收稿日期：2015-04-23；修回日期：2016-03-28