茶多酚对谷氨酸介导的大鼠海马神经元损伤的影响及可能机制

吴焕童，刘婷婷，曹畅,张淑萍Δ，覃筱燕Δ

(1.中央民族大学 北京市食品环境与健康工程技术研究中心，北京 100081；2.中央民族大学 生命与环境科学学院，北京 100081)

茶多酚对谷氨酸介导的大鼠海马神经元损伤的影响及可能机制

吴焕童1,2，刘婷婷1,2，曹畅1,2,张淑萍1,2Δ，覃筱燕1,2Δ

(1.中央民族大学 北京市食品环境与健康工程技术研究中心，北京 100081；2.中央民族大学 生命与环境科学学院，北京 100081)

目的 探讨茶多酚(tea polyphenols，TP)对谷氨酸(Glutamate，Glu)介导的神经元毒性损伤的影响及可能机制。方法 运用大鼠乳鼠海马神经元原代培养细胞，Glu诱导建立细胞损伤模型。实验分6组：对照组、Glu模型组、抑制剂+Glu模型组、TP+Glu组、TP+抑制剂+Glu组和TP组。神经细胞标记微管蛋白β-tubulin Ⅲ染色和DAPI细胞核染色鉴定神经元的纯度和细胞骨架结构形态；MTT法测定细胞活性；Western blot检测细胞中p-Akt和p-Erk 1/2蛋白的表达。结果 β-tubulin Ⅲ和DAPI染色结果显示，培养的海马神经元生长良好，纯度>90%；β-tubulin Ⅲ染色结果显示Glu模型组表现出典型的神经细胞骨架结构损伤的形态特征，TP可拮抗Glu诱导的神经元凋亡的形态学改变；MTT结果显示TP+Glu组细胞存活率明显高于Glu模型组(P<0.001)；与TP+Glu组(1.190±0.2072)相比，TP+ LY29004+Glu组神经元存活率明显减少(P<0.01)；与TP+Glu组(1.861±0.1804)比较，TP+ PD098059+Glu组神经元存活率显著减少(P<0.01)；Western blot结果显示, 与Glu模型组相比，TP+Glu组p-Akt和p-Erk 1/2蛋白表达量均明显升高(P<0.01;P<0.001)。结论 茶多酚对Glu介导的海马神经元损伤具有保护作用，其可能通过上调p-Akt和p-Erk 1/2的表达抑制Glu介导的海马神经元损伤。

茶多酚；谷氨酸；海马神经元；p-Akt；p-Erk 1/2

谷氨酸(Glutamate, Glu)的兴奋毒性引起神经元的凋亡与丢失和很多急慢性神经退行性疾病相关，包括帕金森病(Parkinson’s disease, PD)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)等[1]。Glu过度释放和堆积于细胞外是AD等神经退变病理发展过程的另一个重要问题[1-2]。因此，针对急慢性神经退行性疾病，寻找对抗Glu介导的神经毒性的方法和药物成为一个重要的治疗策略和研究热点[2]。

茶叶具有预防心脑血管疾病、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗炎等多种生物学功能，其主要药理活性成分为茶多酚(tea polyphenols，TP)[3-5]。本课题组前期实验研究表明，TP可通过调节PI3K/Akt信号通路对胞内Aβ1-42诱导的原代培养大鼠前额叶神经元毒性损伤有保护作用[6]，虽然TP抑制胞内、外Aβ毒性引起神经元凋亡的作用已经明确，但其分子作用机制尚不完全清楚,同时TP对Glu诱导的兴奋性神经毒性影响尚未见文献报道。

本实验旨在应用Glu诱导建立原代培养大鼠乳鼠海马神经元损伤模型[1,7]，给予TP预处理,观察TP对Glu介导的神经元损伤的保护作用；并通过在培养基加入PI3K/Akt信号通路抑制剂LY29004和Erk信号通路抑制剂PD098059，观察Glu预处理对抑制Glu介导的神经元毒性损伤细胞存活率的变化，以及磷酸化的Akt(p-Akt)和Erk1/2(p-Erk1/2)表达量的变化，以阐明TP对Glu介导的神经元损伤的保护作用及 p-Akt 和p-Erk 1/2分子在TP对 Glu诱导的兴奋性神经毒性抑制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:新生1日龄SD大鼠乳鼠(北大医学部实验动物中心)。合格证号：SCXK(京)2005-0013。

1.1.2 主要试剂和仪器：茶多酚(TP),为Abcam产品，纯度98%。噻唑蓝(MTT)、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、谷氨酸(Glu)、β-tubulin Ⅲ(兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶抗体)、多聚赖氨酸、β-actin (美国Sigma公司)； DMEM高糖培养基、Neuralbasal medium、 B27、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Invitrogen公司)；p-Erk 1/2和Erk 1/2、 p-Akt和t-Akt、 ERK抑制剂PD098059和Akt抑制剂LY29004(美国CST公司)； DMSO、TBST均为国产分析纯。

BX51-荧光显微镜、CKX41-倒置显微镜(日本Olympus公司)；5417R高速冷冻离心机(德国Eppendodf 公司)；荧光/吸收光酶标仪(美国Thermo公司)； Tanon4200化学发光成像仪(上海天能公司) 。

1.2 方法

1.2.1 神经细胞原代培养及分组处理:无菌条件下分离SD大鼠的海马体，剪碎，0.25%的胰蛋白酶37 ℃下消化30 min左右，取出，用含10%胎牛血清的DMEM液终止消化，轻轻打散细胞团，用200目的过滤筛过滤未消化好的细胞液，1500 r/min离心5 min,去除上清液后，用含10%胎牛血清的DMEM液轻轻吹打沉淀使之形成单细胞悬液，调整细胞密度至1×106个/mL,接种到细胞板上，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后培养液全部换用含10%B27的Neurobasal medium神经元培养基中，以后每两三天半量换液，细胞培养到第7天供实验使用。

实验随机分6组:对照组、Glu模型组、抑制剂+Glu模型组、TP+Glu组、 TP +抑制剂+Glu组和TP组。整个培养过程对照组不加入任何处理因素；细胞培养至第7天时，Glu模型组加入Glu(终浓度40 μmol/L)建立细胞损伤模型；抑制剂+Glu模型组加入PD098059或LY29004(终浓度均为10 μmol/L)及Glu(浓度40μmol/L)；TP+Glu组加入TP(用含10%B27的Neurobasal medium神经元培养基溶解，终浓度10 μmol/L)和Glu(终浓度40 μmol/L)；TP+抑制剂+Glu组加入TP(终浓度10 μmol/L)和Glu(终浓度40 μmol/L)以及PD098059或LY29004(终浓度均为10 μmol/L)；TP组只加入TP(终浓度10 μmol/L)处理。

1.2.2 大鼠乳鼠海马神经细胞鉴定：取培养4～7 d生长在24孔板盖玻片上的大鼠乳鼠海马神经细胞，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定，再用PBS洗涤，用一抗β-tubulin Ⅲ(1:1000)、二抗和DAPI荧光染色，PBS洗涤，封片，荧光显微镜观察，鉴定神经元的纯度和形态。

1.2.3 荧光染色观察细胞骨架形态结构变化：细胞培养同前，分对照组、Glu模型组、TP+Glu组和TP组4组，各组细胞按实验设计给药后继续培养24 h。β-tubulin Ⅲ免疫荧光染色如同1.2.2, 荧光显微镜观察各组细胞骨架形态。

1.2.4 细胞活性检测：细胞活性检测采用MTT 法。细胞培养和分组同1.2.1，每组5个复孔。各组按实验设计给药后继续孵育细胞24 h，之后每孔加入MTT(终浓度0.5 mg/mL), 避光继续孵育4 h于37 ℃、5%CO2培养箱中，吸去培养液,每孔再加入150 μL DMSO液, 室温下置于摇床上振荡15 min，待孔内颗粒完全溶解后,酶标仪570 nm处测定各孔吸光度(A)值，计算各组细胞存活率。

1.2.5 Western blot法检测细胞Akt和Erk 1/2蛋白表达：细胞培养和分组同1.2.3，每组5个复孔。各组按实验设计给药后继续孵育细胞24 h，用0.01M的PBS洗涤3～5次，每孔加入100 μL的细胞裂解液，冰上反应30 min，12000 r/min高速冷冻离心15 min，取上清液。BCA法测定各组蛋白浓度，将每个样品的蛋白浓度调成一致，用10%的SDS-PAGE分离蛋白质，转膜(PVDF膜)，5%的脱脂奶粉封闭30 min，一抗(1:1000)孵育过夜(4 ℃)，TBST洗3～5次，室温下二抗(1:1000)孵育 1 h， TBST洗3～5次，加化学发光液(A液与B液等体积混合)在Tanon4200化学发光成像仪下检测各组未知蛋白质的表达量。

2 结果

2.1 大鼠乳鼠海马神经细胞生长状况 培养4～7 d后，神经和非神经元(主要是星形胶质细胞)之间或神经元之间，连接成紧密的网络，神经元主要生长在非神经元细胞之上。荧光染色结果显示：培养5d的神经元骨架形态完好(绿色标记)，纯度>90% ，达到了实验预期要求。见图1。

图1 大鼠乳鼠海马神经元β-tubulin Ⅲ和DAPI免疫荧光染色结果(×200)绿色为β-tubulin Ⅲ 染色的细胞突起(神经元)，蓝色为DAPI染色的细胞核Fig.1 β-tubulin Ⅲ and DAPI immunofluorescence stained result of hippocampal neurons in rat(×200)β-tubulin Ⅲ appears as green cell processes，DAPI appear as blue cell nucleus

2.2 TP对Glu诱导的神经细胞骨架结构损伤的影响 免疫荧光结果显示：对照组大鼠海马神经元轴、树突密集和细长，排列有序，呈网络状交织，β-tubulin Ⅲ表达高。Glu模型组大鼠海马神经元轴、树突断裂稀小和弯曲，排列紊乱，不交织成网络结构，β-tubulin Ⅲ表达低。TP+Glu组神经元形态与对照组差异不大，轴、树突密集和细长，排列有序，网络状交织，β-tubulin Ⅲ阳性高，与对照组差异不大。TP组细胞β-tubulin Ⅲ形态和表达与对照组差异不大，轴、树突密集细长，网络状交织。说明TP可通过保护细胞内β-tubulin Ⅲ的正常结构及表达对抗Glu诱导的大鼠海马神经元损伤。见图2。

图2 TP对Glu诱导的大鼠海马神经元损伤中β-tubulin Ⅲ形态结构及表达的影响(×200)绿色为β-tubulin Ⅲ荧光染色Fig.2 Effect of TP on β-tubulin Ⅲ structure and expression on Glu-inducted hippocampal neurons in rat (×200)β-tubulin Ⅲ staining is green

2.3 抑制剂对TP保护Glu介导的海马神经元毒性损伤细胞存活率的影响 MTT结果显示：与Glu模型组相比，TP+Glu组神经元存活率明显提高(P<0.001)；与LY29004+Glu模型组相比,TP+ LY29004+Glu组细胞存活率无明显变化；与TP+Glu组相比，TP+ LY29004+Glu组神经元存活率明显减少(P<0.01)，见表1。提示加入Akt阻断剂LY29004后，TP对Glu诱导的神经元毒性损伤的保护作用也被阻止，表明TP抑制Glu诱导的神经元毒性作用与p-Akt的表达有关。

表1 LY29004对各组细胞存活率的影响(n=5)

***P<0.001，与Glu模型组比较, compared with Glu model group；##P<0.01，与TP+Glu组比较，compared with TP+Glu group

与Glu模型组相比，TP+Glu组神经元存活率明显提高(P<0.001)；与PD098059+Glu模型组相比,TP+LY29004+Glu组细胞存活率无明显变化；与TP+Glu组相比，TP+PD098059+Glu组神经元存活率明显减少(P<0.01)，见表2。表明加入Erk阻断剂PD098059后，TP对Glu诱导的神经元毒性损伤的保护作用也被阻止，表明TP抑制Glu诱导的神经元毒性作用与p-Erk 1/2的表达有关。

表2 PD098059对各组细胞存活率的影响(n=5)

***P<0.001，与Glu模型组比较, compared with Glu model group；##P<0.01，与TP+Glu组比较，compared with TP+Glu group

2.4 TP对Glu诱导的神经元损伤p-Akt和 p-Erk 1/2表达量的影响 Western blot结果显示：与对照组相比，Glu模型组p-Akt表达明显降低(P<0.01)；与Glu模型组相比，TP+Glu组p-Akt表达明显升高(P<0.01)，见图3。推测Glu毒性损伤神经元与Akt磷酸化减少有关，TP可通过上调神经元p-Akt表达，抑制Glu介导的细胞毒性损伤，起到修复和保护细胞的作用。

与对照组相比，Glu模型组的p-Erk 1/2表达量明显降低(P<0.001)；与Glu模型组相比，TP+Glu组p-Erk 1/2表达量明显升高(P<0.001)，见图4。推测Glu毒性损伤细胞与Erk磷酸化激活减少有关；TP可通过上调神经元p-Erk 1/2的表达，抑制Glu介导的细胞毒性损伤，起到修复和保护细胞的作用。

图3 TP对Glu 诱导的大鼠海马神经元损伤中p-Akt表达的影响(n=5)**P<0.01，与对照组比较；##P<0.01，与Glu模型组比较Fig.3 Effect of TP on p-Akt expression in Glu-mediated rats hippocampal damage neurons (n=5)**P<0.01,compared with control group; ##P<0.01, compared with Glu group

图4 TP对Glu诱导的大鼠海马神经元损伤中p-Erk 1/2表达的影响(n=5)***P<0.001，与对照组比较；###P<0.001，与Glu模型组比较Fig.4 Effect of TP on p-Erk 1/2 expression in Glu-mediated rats hippocampal damage neurons(n=5)***P<0.001, compared with control group; ###P<0.001, compared with Glu model group

3 讨论

谷氨酸(Glu)是神经系统内重要的兴奋性神经递质，它与神经元快速的突触传递、神经元的可朔性、生长发育、学习、记忆和认知行为功能密切相关，但在病理情况下，如缺血、缺氧、衰老等，会导致Glu的重摄和转运发生障碍，引起Glu的堆积，胞外过多的Glu积累会导致神经元的毒性损伤，进而导致神经元的凋亡[8]。许多研究表明，Glu的毒性效应引起的神经元凋亡与许多神经退行性疾病有关，包括阿尔茨海默病(Alzheimer’disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、亨廷顿病(Huntington’s disease，HD)等[9-11]。尸检发现，AD患者脑内有大量的Glu积累[9,11]，说明Glu可能参与了AD的发病过程。AD的特征之一是谷氨酸激活[12]，谷氨酸NMDA受体的拮抗剂已运用于中、重度AD的治疗[13]。

本实验采用神经元原代培养方法，对神经元进行 β-tubulin Ⅲ和DAPI染色，实验结果显示培养出的海马神经元良好，且纯度>90%。同时MTT实验结果显示，终浓度为40 μmol/L的Glu模型组细胞存活率为60%左右，与正常对照组相比，差异均具有统计学意义(P<0.01或P<0.001)；β-tubulin Ⅲ染色结果显示经Glu处理的模型组大鼠海马神经元骨架结构明显损伤。这些结果都证明了Glu介导的海马神经元毒性效应。

丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路和PI3K/Akt信号通路参与了谷氨酸介导的神经毒性损伤及AD发病机制[7,14-17]。PI3K/Akt 信号通路是调节细胞增殖、分化和凋亡的重要信号转导通路。激活PI3K能使Akt磷酸化而活化，活化的Akt 可以通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bcl2家族、Caspase家族、NF-κB、p53、HSP70等，进而通过多种途径促进神经细胞存活和神经再生，是重要的抗凋亡调节因子[18]。AD发生时PI3K/Akt 信号通路被抑制[19]。在Tg2576 AD小鼠和AD患者脑中观察到磷酸化的Akt(p-Akt )表达下调[16-17]；本课题组前期的研究工作也表明了curcumin可通过上调p-Akt和下调Caspase-3的表达抑制胞内Aβ1-42诱导的大鼠前额叶神经元的毒性[15]。

MAPK信号通路参与了神经系统损伤的发生和修复，及细胞的凋亡和分化[20-21]。细胞外信号调节激酶(external-signal reguated kinase1/2，Erk 1/2)是MAPK信号通路家族中的重要分子，其表达和磷酸化参与应激损伤引起的神经元凋亡和突触传递[22-23]。研究发现，AD病的早期特征之一是Erk1/2信号通路激活，神经元退行性病变有Erk1/2 分子参与[21,23]。Erk1/2激活，p-Erk1/2表达上调参与了微波辐射或氧化应激所致的神经元损伤保护[24]。JNK和p38MAPK的激活在不同的神经细胞模型中表现为促进细胞凋亡的，而Erk1/2的激活则具有拮抗细胞凋亡的作用[24]。

茶多酚(TP)是茶叶中多酚类物质及其衍生物的总称，占茶叶干重的20%～35%，而儿茶素是茶多酚中主要的多酚类化合物，约占茶叶干重的12 %～24 %，主要有表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC) 、没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)4种儿茶素，其中含量最高的是EGCG[6,25]。研究表明茶多酚可通过其强大的抗氧化作用和作为离子螯合剂，助于神经退行性疾病如PD和AD的防治[4-5,24-25]；如能改善动物空间学习记忆障碍及保护神经元免于神经毒性因子的损伤[26]；通过下调ROS-NO对6-OHDA 诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有保护作用[4]等等。本课题组前期研究也报道了茶多酚通过调节PI3K/Akt 信号通路蛋白对胞内Aβ1-42诱导的原代培养大鼠前额叶神经元毒性损伤有保护作用[6]。

本研究应用Glu介导构建海马神经元损伤模型[1,7]，通过TP预给药处理，探讨TP对Glu介导的神经元损伤的保护作用及AKT和 Erk1/2蛋白分子在其中的作用。本实验通过MTT和 β-tubulin Ⅲ染色结果都显示TP抗Glu毒性损伤的保护作用。为验证AKT和Erk1/2的磷酸化激活是否介导TP的保护作用，通过在细胞培养基加入p-Akt和Erk抑制剂LY00094及PD098059(终浓度均为10 μmol/L)，通过MTT法检测各实验组海马神经元细胞存活率。实验结果显示Akt和Erk抑制剂LY00094及PD098059均不同程度的阻断了TP抑制Glu介导的神经元毒性损伤的保护作用。

同时Western blot结果显示，相比对照组，Glu模型组中 p-Akt和p-Erk 1/2表达量明显减少(P<0.001)，而对照组和TP组p-Akt和p-Erk 1/2的表达比较差异并无统计学意义(P<0.01或P<0.001)，说明神经元受到Glu毒性损害时，减少了神经元p-Akt和p-Erk 1/2的表达引起细胞凋亡。而与Glu模型组比较，p-Akt和p-Erk 1/2的表达在TP +Glu组表现出不同程度升高(P<0.01或P<0.001)，推测TP可以介导神经元细胞的p-Akt和p-Erk 1/2表达上调，拮抗Glu引起的神经元损伤，从而保护神经元的生存。

综上所述，本研究揭示了茶多酚对谷氨酸介导的神经元损伤具有保护作用，其可能通过上调p-Akt和p-Erk 1/2的表达抑制谷氨酸诱导的兴奋性神经毒性作用。

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(编校：吴茜)

Effect of tea polyphenols on Glutamate-mediated rats hippocampal neurons damage and its possible mechanism

WU Huan-tong1,2, LIU Ting-ting1,2, CAO Chang1,2, ZHANG Shu-ping1,2Δ, QIN Xiao-yan1,2Δ

(1.Beijing Engineering Research Center of Food Environment and Public Health, Minzu University of China, Beijing 100081; 2.College of Life and Environmental Sciences, Minzu University of China, Beijing 100081)

ObjectiveTo explore the effect of tea polyphenols(TP) on Glutamate(Glu)-mediated rats hippocampal neurons toxic injury and its possible mechanism.MethodsPrimary cultured hippocampal neurons was used and the damage model of Glu-induced nerve cell toxicity was established. The experiment were divided into six groups: control group, Glu model group, inhibitor+Glu model group, TP+Glu group, TP+inhibitor+Glu group and TP group. Nerve cells markers tubulin β-tubulin Ⅲ and DAPI staining were used to detect the purity of neurons and cytoskeleton structure; cell viability was determined by thiazole blue (MTT) method ; Western blot was used to detect p-Akt and p- Erk 1/2 expression.Resultsβ-tubulin Ⅲ and DAPI staining results showed that hippocampal neurons growth well, the purity was above 90%; β-tubulin Ⅲ staining results showed that Glu model group showed a typical morphology characteristics of neuronal cytoskeleton structure damage and TP can inhibits Glu mediated-neuronal Cytoskeleton structure damage; MTT results showed the cell viability of TP+Glu group was significantly higher than Glu model group (P< 0.001); Compared with TP+Glu group(1.190±0.2072) , cell viability of TP+LY29004+Glu group was significantly decreased (P< 0.01); Compared with TP+Glu group(1.861±0.1804) , cell viability of TP+PD098059+Glu group was significantly decreased (P<0.01); Western blot results showed that p-Akt and p-Erk 1/2 protein expression in TP+Glu group were significantly higher than Glu model group(P<0.01;P < 0.001).ConclusionTea polyphenols plays a protective role on Glu-mediated hippocampal neurons injury, it inhibited Glu-mediated neurons toxicity damage may be through up-regulating p-Akt and p-Erk 1/2 expression.

tea polyphenols; Glutamate; hippocampal neurons; p-Akt; p-Erk 1/2

国家自然科学资金(31372225)；中央民族大学985工程(YLDX01013)和社会医学学术团队建设(2015MDTD13C)；高等学校学科创新引智计划(B08044)

吴焕童,女，硕士，研究方向：神经生理及神经药理学，E-mail: 13810472177@163.com；覃筱燕，通信作者，女，硕士，教授，研究方向：神经生理及药理学,E-mail：bjqinxiaoyan@muc.edu.cn；张淑萍，共同通信作者，女，博士，副教授，研究方向：鸟类神经内分泌生理，E-mail：springzsp@sina.com。

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1005-1678(2015)11-0005-05