不同溶剂提取的钩吻粗提物中成分含量的测定

肖　洒，伍　勇，黄亚军，孙志良，刘兆颖

(湖南省植物功能协同创新中心，湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128)



不同溶剂提取的钩吻粗提物中成分含量的测定

肖洒，伍勇，黄亚军，孙志良，刘兆颖*

(湖南省植物功能协同创新中心，湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128)

摘要：钩吻为马钱科钩吻属常绿藤本植物，具有抗肿瘤、免疫调节、促生长等功效，研究表明其主要活性和毒性成分均为吲哚类生物碱。钩吻的药效剂量与中毒剂量十分接近，且致死量低，为给钩吻广泛的临床应用提供理论依据，分别采用酸性染料比色法、苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法对3种不同溶剂工业化提取的钩吻粗取物中生物碱、多糖、蛋白质进行含量测定。结果显示，钩吻醇提(950 mL/L乙醇)、酸水提(5 mL/L H2SO4)、水提物中生物总碱含量分别为64.4 g/L、21.5 g/L和5.7 g/L，糖含量分别为264.1 g/L、89.6 g/L和9.3 g/L，蛋白含量分别为44.7 g/L、12.7 g/L和34.6 g/L。

关键词：钩吻；粗提物；含量测定

钩吻(Gelsemium)又名断肠草、猪人参等，是一种传统的药用植物，主产于亚洲和北美洲。近年来，病菌的抗药性越来越强，严重危害畜群及人类的健康。钩吻作为一种具有促进动物生长发育、增强抗病能力等优点的中草药正逐步为全世界所关注[1]。Yamada Y等[2]从钩吻中分离得到3个新的钩吻定型羟基吲哚类生物碱；Takayama H等[3]在泰国钩吻叶子中分离出2种新的环稀醚萜；Palit P等[4]发现钩吻酊提取物能改善小鼠东莨菪碱诱导的痴呆模型；张振等[5]首次报道在亚洲钩吻中得到Yohimbane-type类型；刘浩等[6]通过高速逆流法分离制备钩吻素子；王海波等[7]通过对肝癌HepG2细胞的研究发现氯通道可能成为钩吻总碱抗癌靶点之一；袁志航等[8]对钩吻生物碱促生长的发展前景进行了探讨。

钩吻有诸多生物学活性，对其生物碱与非生物碱成分的毒性作用研究报道也多[9-10]。本研究通过对3种不同溶剂(950 mL/L乙醇、5 mL/L的H2SO4、水)工业化提取的钩吻成分进行含量测定，从而为进一步研究钩吻的毒性作用机理奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器设备UV-5200型紫外分光光度计，PHB-1型pH计，AY220型电子天平，EASY10型纯水机。

1.1.2试剂钩吻素甲，批号：130228，购自上海康标化学品有限公司；溴甲酚绿，批号：F20140218，购自天津傲然精细化工研究所；醋酸钠，批号：F20110628，冰醋酸，批号：20120822，葡萄糖，批号：F20100330，均购自国药集团化学试剂有限公司；钩吻醇提物由本试验人员于泰谷生物科技有限公司提取；钩吻酸水、水提物由本试验人员于湖南农大药业有限公司提取。

1.2方法

1.2.1溶液的配制钩吻素甲标准品溶液的配制：精密称取钩吻素甲0.010 0 g,甲醇稀释至1 mg/mL，即得。

钩吻醇提物溶液的配制：精密称取钩吻醇提物0.423 0 g，甲醇稀释至10 mg/mL，即得。

钩吻酸水提物溶液的配制：精密称取钩吻酸水提物0.418 0 g，甲醇稀释至10 mg/mL，即得。

钩吻水提物溶液的配制：精密称取钩吻水提物0.670 3 g，甲醇稀释至20 mg/mL，即得。

溴甲酚绿试液的配制：取溴甲酚绿0.1 g，加0.05 mol/L氢氧化钠溶液2.8 mL使溶解，再加水稀释定容至200 mL，即得。

醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5)：取醋酸钠18 g，加冰醋酸9.8 mL，再加水稀释至1000 mL，即得。

醋酸-醋酸钠缓冲液(pH3.6)：取醋酸钠5.1 g，加冰醋酸20 mL，再加水稀释至250 mL，即得。

醋酸-醋酸钠缓冲液(pH5.0)：取醋酸钠54.6 g，加1 mol/L醋酸溶液20 mL，再加水稀释至500 mL，即得。

50 g/L苯酚：80 g苯酚(分析纯重蒸馏试剂)加20 g水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。50 g/L苯酚临用前用800 g/L苯酚稀释。

考马斯亮蓝G-250：称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 950mL/L乙醇中，加入850 g/L磷酸100 mL，最后用蒸馏水定容至1 000 mL。

1.2.2不同溶剂工业化提取钩吻流程

1.2.2.1钩吻醇提物将10 kg钩吻放入提取罐中，加950 mL/L乙醇80 L，提取1.5 h，药液用200目滤网过滤，药渣再同法提取1次，合并2次提取液，置浓缩罐中浓缩至相对密度1.2左右，减压干燥后即得。

1.2.2.2钩吻酸水提物将100 kg钩吻加800 L 5 mL/L的硫酸溶液，于容量为1 000 L的耐酸提取罐中搅拌提取24 h，药液用200目滤网过滤，药渣再同法提取1次，合并2次提取液，用8 mol/L的氢氧化钠调pH至中性，然后放于浓缩罐中浓缩至相对密度1.2左右，减压干燥后即得。

1.2.2.3钩吻水提物将50 kg已经用醇提取过的钩吻放入提取罐中，加400 L水，提取2 h，药液用200目滤网过滤，药渣再同法提取1次，合并2次提取液，置浓缩罐中浓缩至相对密度1.2左右，减压干燥后即得。

1.2.3酸性染料比色法条件的优化经查阅相关文献：分别选取pH为3.6、4.5、6.0；醋酸-醋酸钠缓冲液用量为2、5、7 mL;氯仿用量为5、7、9 mL的溶液建立如表1的正交试验因素表。具体操作步骤如下：精密吸取浓度为1 mg/mL的钩吻素甲标准品溶液50 μL于50 mL离心管中，挥干甲醇，分别按照表2正交试验设计依次加入醋酸-醋酸钠缓冲液，再加入溴甲酚绿溶液，混匀，最后加入氯仿萃取，在40 min时终止反应，移除上清液得氯仿层，在410 nm处测得吸光值。根据吸光值选择测定钩吻生物碱含量的酸性染料比色法的最优反应条件，从而为下步试验的进行奠定基础。

表1　正交试验因素水平表

1.2.4钩吻素甲标准曲线的建立及其醇提、酸水提、水提物中生物碱含量测定精密吸取钩吻素甲溶液25,50,100,150,200,250,300 μL于50 mL离心管中，挥干溶液，按正交试验最佳条件处理，40 min时终止反应，移除上清液得氯仿层，在410 nm处测得吸光值(OD)。以钩吻素甲用量为横坐标，吸光值为纵坐标，得到线性方程。

表2　正交试验表

分别精密吸取10 mg/mL的钩吻醇提、酸水提和20 mg/mL的水提物溶液200 μL于50 mL离心管中，挥干溶液，其他处理方法如上，将测得的吸光值代入上述标曲，分别算得3种不同溶剂提取的钩吻粗提物中生物碱的含量，每管做3个重复。

1.2.5钩吻醇提、酸水提、水提物中糖含量的测定准确称取葡萄糖100 mg于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，分别吸取0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2 mL置于玻璃管中,各以蒸馏水补至2.0 mL，然后加入50 g/L苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0 mL,摇匀冷却，室温放置20 min后于酶标仪492 nm测光密度，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，得标准曲线。

分别吸取2 mL 0.1 mg/mL的醇提、酸水提和1 mg/mL水提物溶液置于玻璃管中，其他处理方法如上，将测得的吸光值代入上述标曲，分别算得3种不同溶剂提取的钩吻粗提物中糖的含量，每管做3个重复。

1.2.6钩吻醇提、酸水提、水提物中蛋白含量的测定精密吸取浓度为0.1 mg/mL的牛血清蛋白标准品0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于具塞试管中，用蒸馏水补足到1 mL,加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，反转混合数次，放置2 min后，在595 nm下比色测得吸光值，以蛋白含量为横坐标，吸光值为纵坐标建立起标曲。

精密吸取浓度为1 mg/mL的钩吻醇提、水提物和5 mg/mL的酸水提物溶液1 mL于具塞试管中，其他处理方法如上，将测得的吸光值代入上述标曲，分别算得3种不同溶剂提取的钩吻粗提物中蛋白含量，每管做3个重复。

2结果

2.1正交试验结果

由表中极差分析可知：影响吸光度因素作用由大到小依次为：缓冲液用量>pH>溴甲酚绿用量>氯仿用量。各因素中以A2B3C3D3为优水平，即缓冲液用量7.0 mL，pH为4.5，溴甲酚绿用量为2 mL，氯仿用量为9 mL时选为试验最佳条件。

表3　正交试验结果

2.2钩吻素甲标准曲线及3种不同溶剂提取的钩吻粗提物中生物碱含量测定结果

钩吻素甲线性方程为：y=4.867 6x+0.1260，R2=0.993 5，当钩吻素甲用量在0.025 mg～0.3 mg范围内，吸光度与对照品用量呈现良好的线性关系。3种不同溶剂提取的钩吻粗提物中生物碱含量测定结果见表4。

表4　生物碱含量测定结果

2.33种不同溶剂提取的钩吻粗提物中糖含量测定结果

葡萄糖线性方程为：y=5.249 4x+0.104 2，R2=0.998 9，当葡萄糖浓度在0～0.6 mg/mL范围内，吸光度与对照品浓度呈现良好的线性关系。3种不同溶剂提取的钩吻粗提物中糖含量测定结果见表5。

表5　糖含量测定结果

2.43种不同溶剂提取的钩吻粗提物中蛋白含量测定结果

牛血清蛋白(BSA)线性方程为：y=5.035 0x+0.133 3，R2=0.985 4，当BSA含量在0.02 mg/mL～0.1 mg/mL范围内，吸光度与对照品含量呈现良好的线性关系。3种不同溶剂提取的钩吻粗提物中蛋白含量测定结果见表6。

表6　蛋白含量测定结果

3讨论

目前生物碱含量测定的方法有：酸碱滴定法、分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法、气相色谱法等[11]。酸碱滴定法测定总生物碱含量时结果误差较大；薄层色谱法仅用于定性试验；色谱法对一种或几种单体生物碱含量进行测定时具有灵敏、准确的优点，但钩吻提取物中生物碱有数十种，而中国以分离纯化的钩吻生物碱单体只有17种，因此用色谱法对其总生物碱含量测定时结果不准确。相关文献报道，采用酸性染料比色法对钩吻生物总碱进行含量测定时发现此法灵敏度高，重现性好[12-13]。糖含量测定方法有：蒽醌-硫酸法、苯酚-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸比色法、斐林试剂比色法等。其中苯酚-硫酸法操作简单、快速、灵敏、重复性好，文献中也多用此法对植物提取物中糖含量进行测定[14-15]。蛋白质含量测定的方法有凯氏定氮法、双缩脲法、考马斯亮蓝法、BCA法等。考马斯亮蓝法测蛋白时灵敏度高、测定快速、耗时少、干扰物质少[16-17]。综上所述，本研究决定分别采用酸性染料比色法、苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法对钩吻生物总碱、糖、蛋白质进行含量测定，为进一步试验提供理论依据。

试验结果显示，钩吻3种不同溶剂提取的粗提物中生物碱含量高低排序为醇提物>酸水提物>水提物。原因分析：生物碱是植物体中一类含氮的碱性有机化合物，多为结晶性固体，易溶于有机溶剂，如甲醇、乙醇、乙醚、苯等，不溶或难溶于水[17]，故钩吻醇提物中生物碱含量高于水提物中生物碱含量；乙醇是一种亲水性的浸出溶剂，易透入药材组织，能使生物碱更多溶解出来，而酸水提物水溶性杂质(如蛋白质、糖、鞣酸)较多，生物碱的溶出则相对少一些，故钩吻醇提物生物碱含量要高于酸水提物生物碱含量；一般情况下生物碱不溶或难溶于水，但在酸性条件下，生物碱与酸形成盐，而生物碱盐则易溶于水，故钩吻酸水提物中生物碱含量高于水提物中生物碱含量。

本研究通过后续小鼠急性毒性试验发现钩吻提取物半数致死量(LD50)高低排序为水提物>酸水提物>醇提物，进一步论证了钩吻生物总碱含量的高低与其毒性相关的论点，从而为下步合理应用钩吻生物碱奠定了一定基础。

钩吻3种不同溶剂提取的粗提物中蛋白质含量高低排序为醇提物>水提物>酸水提物。原因分析：蛋白质是一类大分子物质，多数可溶于水，一般不溶于有机溶剂，但麦角蛋白质却能溶于较浓的乙醇，这与钩吻醇提物中蛋白质含量稍高于酸水、水提的结果类似。在酸性条件下，蛋白质可能部分发生变性，从而使得酸水提物中蛋白质的含量要低于水提物的。

植物体内的蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，对其含量进行测定是了解代谢机理的一个重要指标，可为下步研究钩吻是否通过酶代谢途径产生毒性这方面考察奠定基础。

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Content Determination of Ingredients in Three Different Crude Extracts ofGelsemiumelegans

XIAO Sa,WU Yong,Huang Ya-jun,SUN Zhi-liang,LIU Zhao-ying

(HunanCo-InnovationCenterforUtilizationofBotanicalFunctionalIngredients，CollegeofVeterinaryMedicine，HunanAgriculturalUniversity，Changsha，Hunan,410128，China)

Abstract:Gelsemiumelegansis an evergreen liana of Loganiaceae,which has anti-tumor,immunomodulation,promoting growth and other effects.Research showed that the main active and toxic ingredients are indole alkaloids.The efficacy dose and toxic dose ofGelsemiumare very close,and lethal dose is low.To provide a theoretical basis for a wide range of clinical applications toGelsemium,acid dye colorimetry,phenol-sulfuric acid method,Coomassie brilliant blue method were respectively used to determine alkaloids,polysaccharides, proteins of three crude extracts from three different extraction solvents in this study.The results showed that total alkaloids contents of ethanol extract (95% ethanol),acid extract (0.5% H2SO4),water extract ofGelsemiumwere 6.44%,2.15%,0.57%,sugar contents were 26.41%,8.96%,0.93%,protein contents were 5.91%,1.36%,4.23% ,respectively.

Key words:Gelsemium; crude extracts;content determination

收稿日期：2015-11-19

作者简介：肖洒(1990-)，男，湖南常德人，主要从事兽医药理与毒理学研究。*通讯作者

中图分类号:S852.7

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)06-0072-05