辅助性T淋巴细胞17/调节性T淋巴细胞平衡在乙型肝炎病毒感染相关肝纤维化进展过程中的作用研究

刘怀鄂，游 晶，洪 敏，张艳梅，张 禄，陆丽蓉，张茹薏，丁 洁



·论著·

辅助性T淋巴细胞17/调节性T淋巴细胞平衡在乙型肝炎病毒感染相关肝纤维化进展过程中的作用研究

刘怀鄂，游 晶，洪 敏，张艳梅，张 禄，陆丽蓉，张茹薏，丁 洁

650032云南省昆明市，昆明医科大学第一附属医院感染科(刘怀鄂，游晶，张艳梅，张禄，陆丽蓉，张茹薏，丁洁)，肿瘤治疗中心(洪敏)

【摘要】目的探讨辅助性T淋巴细胞17(Th17)/调节性T淋巴细胞(Treg)平衡在乙型肝炎病毒(HBV)感染相关肝纤维化进展过程中的作用。方法选取2011年1月—2015年6月昆明医科大学第一附属医院收治的未经抗病毒治疗的HBV感染者104例为研究对象，依据肝脏硬度测量值(LSM)将患者分为轻度肝纤维化组29例(LSM<9.7 kPa)、中度肝纤维化组53例(9.7 kPa≤LSM<17.5 kPa)、重度肝纤维化组22例(LSM≥17.5 kPa)。记录所有患者性别、年龄、乙型肝炎家族史、体质指数(BMI)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)。采用流式细胞仪检测外周血中Th17、Treg表达率，计算Th17/Treg比值。结果3组患者性别、乙型肝炎家族史、BMI比较，差异无统计学意义(P>0.05)；中度肝纤维化组、重度肝纤维化组患者年龄大于轻度肝纤维化组，ALT水平高于轻度肝纤维化组(P<0.05)；重度肝纤维化组患者年龄大于中度肝纤维化组(P<0.05)。中度肝纤维化组患者Th17表达率、Th17/Treg比值高于轻度肝纤维化组(P<0.05)；重度肝纤维化组患者Treg表达率低于轻度肝纤维化组，Th17/Treg比值高于轻度肝纤维化组(P<0.05)。Th17表达率为2.5%(3.6%)，Treg表达率为1.0%(1.0%)，ALT水平为47.2(36.2)U/L，LSM为12.8(6.9)kPa。Th17表达率与Treg表达率呈正相关(rs=0.231，P=0.018)；LSM与Th17表达率(rs=0.162，P=0.428)、ALT水平(rs=0.201，P=0.526)无直线相关关系；LSM与Treg表达率呈负相关(rs=-0.215，P=0.041)；LSM与Th17/Treg比值呈正相关(rs=0.268，P=0.019)。结论在HBV感染致相关肝纤维化进程中，Th17调控作用不明确，Treg有明显的负向调控作用，Th17/Treg平衡具有重要意义。

【关键词】乙型肝炎病毒；肝纤维化；T淋巴细胞，辅助；T淋巴细胞，调节性

刘怀鄂，游晶，洪敏，等.辅助性T淋巴细胞17/调节性T淋巴细胞平衡在乙型肝炎病毒感染相关肝纤维化进展过程中的作用研究[J].中国全科医学，2016，19(18)：2126-2129.[www.chinagp.net]

Liu HE，You J，Hong M,et al.Study on the role of the balance Th17/Treg in the development of hepatitis B virus-related liver fibrosis[J].Chinese General Practice，2016，19(18)：2126-2129.

肝硬化及其相关并发症是导致乙型肝炎病毒(HBV)感染相关肝脏疾病患者死亡的主要原因，据世界卫生组织统计，全球每年约有65万人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化、肝癌[1]。而导致肝硬化，甚至肝硬化失代偿的病理学基础是肝组织纤维化进展。但究竟对肝脏炎性反应具有调节作用的辅助性T淋巴细胞17(Th17)和调控作用的调节性T淋巴细胞(Treg)在HBV感染患者肝纤维化进展过程中的作用如何，尚缺乏足够的研究。本研究通过比较不同肝纤维化程度的HBV感染患者外周血Th17、Treg表达率及Th17/Treg比值的变化情况，观察Th17/Treg细胞平衡在HBV感染患者肝纤维化进展过程中的作用。

1材料和方法

1.1纳入与排除标准纳入标准：(1)符合2010版《慢性乙型肝炎防治指南》[2]中乙型肝炎的诊断标准；(2)体质指数(body mass index,BMI)<28 kg/m2[3]；(3)丙氨酸氨基转移酶(ALT)<80 U/L[4]。排除标准：(1)甲、丙、丁、戊型肝炎及免疫缺陷性疾病；(2)肝癌、自身免疫性疾病、脂肪肝、酒精肝；(3)吸毒史及毒物接触史；(4)孕妇和体内植入活性医疗器械；(5)B超提示腹腔积液。

1.2研究对象选取2011年1月—2015年6月昆明医科大学第一附属医院门诊及住院部收治的未经抗病毒治疗的HBV感染者104例为研究对象，均符合纳入与排除标准。依据肝脏硬度测量值(liver stillness measurement，LSM)将患者分为轻度肝纤维化组29例(LSM<9.7 kPa)、中度肝纤维化组53例(9.7 kPa≤LSM<17.5 kPa)、重度肝纤维化组22例(LSM≥17.5 kPa)。本研究经昆明医科大学第一附属医院伦理委员会批准，患者均知情同意并签署知情同意书。

1.3方法

1.3.1一般资料记录所有患者性别、年龄、乙型肝炎家族史、BMI、ALT。清晨空腹采集所有患者静脉血2～3 ml，置入EDTA抗凝管中，采用全自动生化分析仪奥林巴斯AU-5400及配套试剂检测ALT水平；患者取平卧位，按照FibroScan-502肝纤维化扫描仪(法国爱科森公司)操作说明测量患者体表相同部位的LSM。

1.3.2Th17、Treg表达率检测采集所有患者清晨空腹静脉血2～3 ml，置入EDTA抗凝管中，采用密度梯度离心法提取外周血单个核细胞(PBMC)备用。每1×106个细胞加入佛波酯(PMA，SIGMA公司)50 ng/ml、离子霉素(Ion，SIGMA公司)1 μg/ml，并在含高尔基蛋白转换抑制剂的1640培养基中刺激5 h。以250×g离心5 min后，将重悬的细胞按流式细胞仪检测试剂盒(BD公司)要求进行固定、染色、透化处理〔Th17采用白介素17细胞内染色，Treg采用叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3)细胞内染色〕，标记后的细胞采用流式细胞仪检测，并采用Diva软件分析Th17、Treg表达率，计算Th17/Treg比值。

2结果

2.13组患者一般资料比较3组患者性别、乙型肝炎家族史、BMI比较，差异无统计学意义(P>0.05)；3组患者年龄、ALT水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；中度肝纤维化组、重度肝纤维化组患者年龄大于轻度肝纤维化组，ALT水平均高于轻度肝纤维化组，差异有统计学意义(P<0.05)；重度肝纤维化组患者年龄大于中度肝纤维化组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.23组患者外周血中Th17、Treg表达率、Th17/Treg比值比较3组患者Th17、Treg表达率、Th17/Treg比值比较，差异有统计学意义(P<0.05)。中度肝纤维化组患者Th17表达率、Th17/Treg比值高于轻度肝纤维化组，差异有统计学意义(P<0.05)；重度肝纤维化组患者Treg表达率低于轻度肝纤维化组，Th17/Treg比值高于轻度肝纤维化组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表1　3组患者一般资料比较

注：a为χ2值；与轻度肝纤维化组比较，bP<0.05；与中度肝纤维化组比较，cP<0.05；BMI=体质指数，ALT=丙氨酸氨基转移酶

表23组患者外周血中Th17、Treg表达率及Th17/Treg比值比较

〔M(QR)〕

Table 2Comparison of Th17 and Treg frequency,Th17/Treg ratio in peripheral blood among the three groups

组别例数Th17表达率(%)Treg表达率(%)Th17/Treg比值轻度肝纤维化组291.6(1.9)1.1(1.3)1.2(2.0)中度肝纤维化组533.0(4.3)a1.0(1.1)3.3(4.4)a重度肝纤维化组222.9(2.8)0.7(0.6)a3.5(5.5)aH值7.6546.11515.580P值0.0220.0470.001

注：与轻度肝纤维化组比较，aP<0.05；Th17=辅助性T淋巴细胞17，Treg=调节性T淋巴细胞

2.3相关性分析Th17表达率为2.5%(3.6%)，Treg表达率为1.0%(1.0%)，ALT水平为47.2(36.2)U/L，LSM为12.8(6.9)kPa。Th17表达率与Treg表达率呈正相关(rs=0.231，P=0.018)；LSM与Th17表达率(rs=0.162，P=0.428)、ALT水平(rs=0.201，P=0.526)无直线相关关系；LSM与Treg表达率呈负相关(rs=-0.215，P=0.041)；LSM与Th17/Treg比值呈正相关(rs=0.268，P=0.019)。

3讨论

既往关于肝纤维化进展机制的相关研究主要集中在肝星形细胞活化、肝内细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的异常堆积、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)在肝纤维化进展中的作用等方面。多数研究认为，当肝脏受到炎性反应机械刺激等损伤时，肝星形细胞将被激活，从而产生胶原、蛋白多糖、糖蛋白等细胞外基质，导致ECM异常堆积，最终导致肝纤维化的发生[5-9]。TGF-β可以通过激活Smad信号通路活化肝星形细胞，促进ECM的产生，同时抑制胶原酶分解[10]。也有研究认为，肝脏非特异性免疫细胞在肝纤维化进展中发挥重要作用，如自然杀伤细胞可以通过清除活化的肝星形细胞来减少肝纤维化[11]，但究竟肝脏炎症的调控细胞在肝纤维化进展过程中的作用如何并不清楚。

肝脏的损伤与修复失衡是肝纤维化进展的重要原因之一，而既往研究一定程度上忽视了肝脏炎症调控细胞在肝脏纤维化进展过程中的意义，尤其是对于慢性持续性肝脏炎性反应患者，如慢性乙型肝炎，其肝脏炎症调控细胞在肝纤维化进展过程中的作用可能更为重要。早期临床研究发现，Treg通过白介素10调控TGF-β在组织纤维化中的作用[12]。而近期关于丙型肝炎、血吸虫肝硬化、阻塞性黄疸的研究亦证实，活化Treg对组织纤维化进程存在控制作用[13-15]。也有研究提出，Th17在HBV感染过程中具有促进肝纤维化进展的作用[16]，Th17/Treg失衡可能在四氯化碳诱导的肝纤维化进展中发挥促进作用[17]。有关腹膜纤维化的研究结果发现，使用能够活化Treg和减少白介素17产生的免疫调节药物可以减少纤维化的发生[18]。但关于HBV感染的相关研究认为，Treg会抑制针对HBV的免疫反应，最终可能使HBV无法清除，进而导致炎症持续活动、肝纤维化进展。Th17、Treg以及Th17/Treg平衡在HBV感染患者相关肝纤维化进展中的作用研究非常有限，这使得对炎症调控具有重要意义的Th17及Treg在HBV感染患者相关肝纤维化进展中的作用尚不清楚。

本研究结果显示，3组患者性别、乙型肝炎家族史、BMI间无差异，而年龄间差异明显，且重度肝纤维化组患者年龄最大，轻度肝纤维化组患者年龄最小，提示随着年龄的增加，肝纤维化程度有进行性加重趋势。中度肝纤维化患者及重度肝纤维化患者的ALT水平均高于轻度肝纤维化患者，提示肝脏炎性反应在肝脏纤维化进展中存在促进作用。中度肝纤维化组患者Th17表达率、Th17/Treg比值高于轻度肝纤维化组；重度肝纤维化组患者Treg表达率低于轻度肝纤维化组，Th17/Treg比值高于轻度肝纤维化组，提示Th17在HBV感染患者肝纤维化进展过程中并不能独立发挥促进作用，而Treg在肝纤维化进展过程中的负向调节作用比较明确，Th17/Treg比值可以独立、准确地反映肝纤维化进展情况。有研究显示，Th17/Treg失衡可能广泛存在于肝纤维化进展的患者中，这可能是导致肝星形细胞活化的重要原因[19]。相关性分析结果显示，Th17表达率与Treg表达率呈正相关。LSM与Th17表达率、ALT水平无直线相关关系，LSM与Treg表达率呈负相关,LSM与Th17/Treg比值呈正相关；提示对于HBV感染患者，其外周血Th17、Treg间存在平衡关系，单独的Th17表达率及ALT水平无法反映肝脏实际的纤维化情况，而Treg表达率、Th17/Treg比值与肝纤维化程度有较好的一致性，本研究结果与相关研究结果类似[11-13]。但本研究缺乏动态的延续性试验结果，连续性地观察多个时间点的外周血Th17、Treg表达率可提高结果的可靠性。

综上所述，Th17、Treg虽然同为HBV感染患者肝纤维化进展过程中炎性反应的重要调控细胞，但Th17在肝纤维化进展过程中调控作用不明确，Treg有明显的负向调控作用，且Th17/Treg平衡具有重要意义。这为临床在慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗的同时如何能最大限度的保存肝脏功能、维持肝脏的正常组织学形态提供了新的思路。

作者贡献：刘怀鄂、游晶进行试验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；洪敏、张艳梅、张禄、陆丽蓉、张茹薏、丁洁进行试验实施、评估、资料收集；游晶进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：毛亚敏)

Study on the Role of the Balance Th17/Treg in the Development of Hepatitis B Virus-related Liver Fibrosis

LIUHuai-e，YOUJing，HONGMin,etal.

DepartmentofInfectiousDisease，theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650032，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the role of the balance between T helper 17 cells(Th17) /regulatory T cells(Treg) in the development of hepatitis B virus-related(HBV-related) liver fibrosis.MethodsA total of 104 HBV-infected people from the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University were recruited from January 2011 to June 2015,all patients had no antiviral treatment history.Based on the liver stiffness measurements(LSM),all patients were divided into mild hepatic fibrosis group(LSM <9.7 kPa,29 cases),moderate liver fibrosis group(9.7 kPa≤LSM <17.5 kPa,53 cases) and severe liver fibrosis group(LSM≥17.5 kPa,22 cases).The sex,age,family history of hepatitis B,body mass index(BMI),and alanine aminotransferase(ALT) were recorded in all patients.To find cell frequency of Th17 and Treg in peripheral blood by using flow cytometry,then the ratio of Th17/Treg was calculated.ResultsThere was no significant difference in the sex,family history of hepatitis B and BMI among the three groups(P>0.05).The age of moderate hepatic fibrosis group and severe liver fibrosis group were higher than that in mild hepatic fibrosis group,and ALT levels were higher than that in the mild hepatic fibrosis group(P<0.05).The age of severe liver fibrosis group was higher than that in moderate hepatic fibrosis group(P<0.05).Th17 frequency and the ratio of Th17 to Treg in moderate liver fibrosis group was significantly higher than those in mild liver fibrosis group(P<0.05)；Treg frequency in severe liver fibrosis group was significantly lower than that in mild liver fibrosis group,but the ratio of Th17 to Treg in severe liver fibrosis group was significantly higher than that in mild liver fibrosis group(P<0.05).Th17 frequency was 2.5%(3.6%),Treg frequency was 1.0%(1.0%),ALT level was 47.2(36.2) U/L,LSM was 12.8(6.9) kPa.The frequency of Th17 were positively correlated with frequency of Treg(rs=0.231，P=0.018)； there was no linear correlation between the LSM and the Th17 frequency(rs=0.162，P=0.428) or ALT levels (rs=0.201，P=0.526)； the frequency of Treg was negatively correlated with LSM(rs=-0.215，P=0.041)； the ratio of Th17/Treg was positively correlated with LSM (rs=0.268，P=0.019).ConclusionIn the development of HBV-related liver fibrosis，the regulatory effects of Th17 was not clear,Treg have obvious regulatory effects，the balance Th17/Treg has important significance.

【Key words】Hepatitis B virus；Liver fibrosis；T-lymphocytes,helper；T-lymphocytes,regulatory

基金项目:云南省科技厅应用基础研究面上项目(2011FZ121)

通信作者：游晶，650032云南省昆明市，昆明医科大学第一附属医院感染科；E-mail：jingyoukm@126.com

【中图分类号】R 575.2

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.18.003

(收稿日期：2016-03-08；修回日期：2016-05-15)

·专题研究·