水产品质量与安全控制的蛋白质组学研究

赵永强，李娜、2，李来好，杨贤庆，郝淑贤，魏涯，岑剑伟

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东 广州510300；2.上海海洋大学食品学院，上海201306）



水产品质量与安全控制的蛋白质组学研究

赵永强1，李娜1、2，李来好1，杨贤庆1，郝淑贤1，魏涯1，岑剑伟1

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，国家水产品加工技术研发中心，广东 广州510300；2.上海海洋大学食品学院，上海201306）

摘要：概述了蛋白质组学研究中主要应用的技术与工作流程；分别从水产生物生长环境、捕获方式、饲料成分、加工与贮藏方式等方面介绍了蛋白质组学技术在水产品品质研究中的应用；从微生物污染物鉴别、过敏原检测、原料鉴别3个方面综述了蛋白质组学技术在水产品安全研究方面的应用现状；对目前蛋白质组学技术应用中存在的诸如2-DE电泳重现性差以及由水产品蛋白质分子量大、溶解度低、离子化水平低带来的局限性等问题进行了探讨，并就此展望了新技术开发、多种组学方法结合和完善水产生物基因与蛋白质数据库等方面的发展前景，旨在为更好地开展水产品蛋白质组学研究提供参考。

关键词：水产品；蛋白质组学；质量与安全

据FAO统计，2012年全球水产品产量已达1.58×108t，并呈连年增长趋势，全球年人均消费量由20世纪60年代的9.9 kg增长到19.2 kg［1］。作为高值食品原料，水产品中富含ω-3多不饱和脂肪酸、维生素和矿物质，是人类膳食的主要优质蛋白质来源之一［2］，对水产品品质与安全方面的研究成为近年热点。蛋白质作为水产品的主要组成成分和营养载体，几乎在所有的生物进程中均充当重要角色，是水产养殖、加工、贮藏和质量安全等相关领域的主要研究对象。除此之外，蛋白质还起到结构支撑及参与生命系统中各种生理功能 （如催化、防御、运输和传感等）的作用，鱼类水产品中蛋白质平均含量达16% ～25%，因此，分析水产品中的蛋白质，可增加人们对水产品原料品质、安全性、加工特性和加工方法等方面的认识，有助于提高水产品的品质及质量安全水平。

蛋白质组 （proteome）由澳大利亚学者Wilkins 和Williams首次提出［3］，指 “细胞、组织或机体内的基因在特定生理条件下表达的所有蛋白质”。蛋白质组学 （proteomics）是对一个机体的全部蛋白质进行系统的研究，包括蛋白质的变化、翻译后修饰 （post-translational modifications，PTM）和蛋白质与蛋白质之间的相互作用［4］。水产品品质及安全受到原料生长环境、捕获方式、加工方法和贮藏条件等诸多因素影响，通过蛋白质组学技术可分析水产品中过敏原、分子标记物、蛋白质含量水平和动态变化，并可鉴定水产品原料、腐败微生物和致病菌，有助于了解水产品加工贮藏过程中品质变化规律并保障水产品安全［5］。本研究中，在简要介绍蛋白质组学主要研究技术的基础上，对水产品质量与安全控制研究中的蛋白质组学相关研究报道进行分类综述，并对其发展趋势及面临的挑战进行展望，旨在为水产品蛋白质组学研究提供参考。

1　蛋白质组学主要研究技术与工作流程

图1　蛋白质组学研究的主要工作流程［7］Fig.1 Typical workflows of proteomics study

2　水产品质量控制中的蛋白质组学研究

将蛋白质组学应用于水产品品质研究的主要目标是获取水产品品质变化中蛋白质的作用机制。目前，关于水产品品质的研究报道较多，其中，影响水产品质量的主要因素在水产生物死亡前有饲料组成、养殖环境温度、死前应激、致死方式等，而在水产生物死后则有加工方法、死后僵直、贮藏温度和时间等［7］。

2.1水产生物死前 （ante mortem）

2.1.1生长环境 与野生水产品不同，养殖过程中的饲料组成、投料方式、养殖密度、养殖水体质量均会对养殖水产品的感官、质构特性和营养成分［8］造成较大影响。Monti等［9］采用蛋白质组学技术研究了养殖方式对鲈Dicentrarchus labrax蛋白质表达产生的影响，并比较了野生及养殖鲈肌肉水溶性蛋白质的差异。结果表明，由于生长条件和饲养方式的不同，养殖鲈与糖类代谢相关的酶的表达显著提高，且肌肉中主要过敏原小清蛋白的表达较野生鲈减少了22%。而Addis等［10］利用差异蛋白质组学技术比较了近海网箱养殖大西洋鲷Sparus aurata与野生大西洋鲷肌肉主要蛋白质表达差异。结果表明，两种大西洋鲷肌肉蛋白质表达无显著性差异，且近海网箱养殖能提高产量。此外，关于养殖与野生的鳕 Gadus morhua［11-12］、大西洋比目鱼Hippoglossus hippoglossus［13］蛋白质组差异也有相关研究报道。利用蛋白质组学对性质差异的蛋白质进行表征并研究其动态变化，可为鱼类养殖条件的优化提供理论基础，以获得理想肌肉蛋白质组成的高品质水产品加工原料。

2.1.2捕获方式及死前应激 鱼类捕获前的应激反应可影响其肌肉品质，欲揭示不同应激源刺激下鱼类相关生理反应的潜在机制，需要以大量的蛋白质组学研究为基础。水产养殖中常见的应激源是不同时间阶段下鱼类的不同聚集密度 （如鱼类的集中运输或宰杀）。Morzel等［14］在高于50 kg/m3的密度下，以鱼类宰杀前聚集15 min为诱导因素，用双向凝胶电泳技术研究虹鳟Oncorhynchus mykiss白色肌肉中蛋白质表达后的修饰特征，死后45 min取样分析。结果发现，聚集诱导和对照组中有29个蛋白质点的表达具有差异性，鉴定出的蛋白质点主要是与能量生成通路相关的蛋白质和结构蛋白质，聚集应激作用下虹鳟肌肉的连接蛋白（desmin）含量低于对照组，由于连接蛋白为鱼的肌肉细胞骨架的主要组成成分，因此，聚集应激作用对鱼的肌肉完整性及质构特性均会产生不良影响。与此相似，Veiseth-Kent等［15］在大西洋鲑肌肉与血浆中分别发现了27个和17个差异蛋白质点。经鉴定发现，这些蛋白质与其能量代谢、渗透压调节和免疫功能相关，聚集应激后的鱼的肌肉主要发生了结构蛋白质 （如肌动蛋白、原肌球蛋白、肌球蛋白重链和轻链）的水解和/或解离作用，另外，与对照组相比，聚集应激后大西洋鲑血浆中载脂蛋白A-I（apolipoprotein A-I）含量降低，而血管紧张素原组成成分C3含量升高，这说明短期的聚集应激可能导致了大西洋鲑免疫系统的变化，从而可进一步解释聚集应激促进鱼体肌肉pH下降及死后僵直收缩的作用机制。此外，还有研究者利用蛋白质组学技术探明了夏季产卵期被捕获金枪鱼和鲭鱼肌肉暗红、水分含量偏高且质构偏软的原因［16］。王彦波等［17］对鲫采取不同的宰杀方式，然后对其蛋白质组进行了分析。结果显示，与直接打头致死组相比，氮气致死组凝胶中的小分子蛋白质点多，相同蛋白质的相对含量低，分布面积大，表明宰杀方式会影响鲫肌肉中蛋白质的含量和代谢，从而间接影响鲫肌肉的硬度、胶黏性和咀嚼性。水产品品质与其肌肉品质关系密切，利用蛋白质组学研究肌肉蛋白质的种类、含量、结构和功能变化，易于从分子水平上揭示水产动物死前应激反应对其品质的影响机制。

2.1.3饲料成分 关于饲料组成对鱼体肌肉营养成分［18］和肝脏蛋白质组影响的研究已有报道，但直接探讨鱼饲料与鱼肉品质之间关系的蛋白质组学研究较少。Kolditz等［19］通过对虹鳟肝脏的蛋白质组学与转录组学分析，研究了饲料能量摄入对其肌肉脂肪含量的影响机制。结果表明，采用高能量、高脂肪含量饲料饲养的虹鳟，其肝脏新陈代谢的变化可调控其肌肉脂肪的分配，与低能量饲料相比，高能量饲料饲养的虹鳟肝脏中与细胞内脂质转运、呼吸链、糖酵解、糖异生和氨基酸代谢相关的蛋白质表达水平较低，这些蛋白质可用作防止肌肉脂肪过度积累的标志物。Martin等［20］通过对摄入大豆蛋白质源饲料的虹鳟肝脏蛋白质进行2-DE分析，结果发现，摄入大豆蛋白质越多，其蛋白质消耗速率越快，且氨排泄增多，肝脏谷氨酸酶及天门冬氨酸氨基转移酶活性增加，导致虹鳟能量代谢加快，但结构蛋白质合成速率变慢，进而对其肌肉蛋白质组成及质构品质造成影响。

2.2水产生物死后 （post mortem）

水产品质构特性是评价其品质的一个重要方面，与水产品蛋白质特性密切相关，水产品在贮藏期间质构特性会发生变化。关于水产生物死后机体加速排酸的生化过程近年来研究广泛，多数研究结果认为，该过程由不同的蛋白质水解系统参与［7］。然而，该过程更多重要的细节仍然未知，运用蛋白质组学可以更深入地了解水产生物死后储藏过程中的品质变化。

水产品中多不饱和脂肪酸组分是其储藏过程中发生氧化腐败的主要物质，脂质氧化副产物可触发水产品肌肉蛋白质发生氧化作用，蛋白质发生氧化后会引起蛋白质聚合，从而导致其溶解性降低，影响水产品品质［21-22］。由活性氧 （reactive oxygen species，ROS）氧化蛋白质后生成的醛酮类物质可用来进行2-DE分析。Kjærsgård等［23］早期利用2，4-二硝基苯肼 （DNPH）标记虹鳟蛋白质羰基后进行2-DE分析。结果表明，虹鳟在贮藏过程中，仅有一些特殊蛋白质特别是肌原纤维蛋白发生了氧化羰基化反应。随后Kjærsgård等［24］又研究了虹鳟冻藏过程中蛋白质复杂的氧化过程。结果显示，在较高贮藏温度下，虽然所有蛋白质的羰基化水平均有所增加，但蛋白质羰基化程度均与储藏温度无关，鱼肉中多数高丰度蛋白质发生羰基化反应，而某些低丰度蛋白质 （如核苷二磷酸激酶、肝酰酸激酶等）被氧化的更严重，表明蛋白质对氧化羰基化反应的敏感性具有差异。

Terova等［25］深入研究了海鲈Dicentrarchus labrax在不同贮藏温度下蛋白质降解引起的蛋白质图谱的变化。结果发现：在18℃下贮藏时，海鲈肌肉蛋白质组成发生的变化最为显著，尤其是肌球蛋白重链与甘油醛-3-磷酸脱氢酶发生了明显的降解反应；而在1℃贮藏时，一些蛋白质含量在贮藏期间发生较小程度的变化；此外，还发现了核苷二磷酸激酶B含量在恒温储藏过程中显著降低，这与Verrez-Bagnis等［26］的研究结果相一致，即相对分子质量为16 000（pI 6.67）的蛋白质在储藏过程中逐渐消失，因此，该蛋白质可作为海鲈新鲜度指示蛋白质。Kjærsgård等［27］研究了鳕肌肉蛋白质在8 d储藏期间的变化。结果显示，有11个蛋白质点有明显的变化，9个蛋白质点含量增加，其中8个蛋白质点在鱼死后2 h内增加显著 （P＜0.05）；相反，有2个蛋白质点在储藏8 d后丰度显著下降（P＜0.05）。这表明，鳕死后肌肉蛋白质的变化具有不同的生化过程。

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蛋白质组学技术还可用于鱼类特殊指示蛋白质的筛选。Liu等［28］用 2-DE法分离红鳍东方鲀Takifugu rubripes骨骼肌蛋白质，用银染法检测到112个蛋白质点，用MALDI TOF/TOF MS法鉴定出21种蛋白质，其中有6种结构蛋白，6种已知功能的蛋白质和9种新蛋白质，这些蛋白质具有不同的细胞功能，有利于进一步调查筛选用于监控鱼肉质量的标记蛋白质。Pazos等［29］用 2-DE法和MALDI-TOF/TOF质谱法相结合，研究了鳕肌质和肌纤维中肌肉蛋白质对体外催化氧化的敏感性，试图筛选在鱼类品质劣化中起重要作用的物质。结果显示，使用荧光素-5-氨基硫脲 （Fluorescein-5-thiosemicarbazide，FTSC）标记羰基，经2-DE法分离后采用MALDI-TOF/TOF质谱法鉴定，筛选到7种最易被亚铁催化氧化的蛋白质。李学鹏［30］运用蛋白质组学的方法研究了中国对虾 Penaeus chinensis肌肉蛋白质在冷藏过程中的变化，筛选出5个在储藏过程中呈规律性变化的差异蛋白点，可作为冷藏中国对虾新鲜度指示蛋白质。

以蛋白质组学技术为手段对水产品品质的研究报道逐年增加，当前该领域的研究多集中于水产食品与蛋白质关联的品质与营养分析方法方面。水产食品行业发展至今，人们对水产食品品质的要求越来越高，要求水产品加工原料的品质能够达到加工要求，通过蛋白质组学技术筛选的与水产品品质相关的生物标记物，可与水产品养殖、加工和贮藏过程中的诸多因素相关的标记物相结合，形成以水产品品质为驱动的强大工具，优化养殖条件、加工工艺和贮藏方式等，最大限度地保证水产品品质，满足消费者需求。

3　水产品安全控制中的蛋白质组学研究

水产品作为人类健康饮食的重要部分，其质量安全方面的问题备受关注。目前，水产品质量安全面临的挑战主要集中于如何使用先进强大的技术工具快速准确地检测水产品原料本底以及加工、包装、贮藏、运输过程中产生的毒素和危害化合物、微生物和过敏原等，蛋白质组学技术在水产品安全控制研究中的应用主要集中在以下几个方面。

3.1微生物污染物鉴别

水产品微生物污染物的鉴别主要是基于免疫化学技术及传统的微生物筛选培养鉴别法。近年来，随着蛋白质组学技术的发展，涌现出一批更灵敏、更专一的鉴别方法。水产品中的食源性致病菌主要有副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus、单核细胞增生李斯特菌Listeria monocytogenes、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大肠杆菌 Escherichia coli O157：H7、空肠弯曲杆菌Campylobacter jejuni、某些沙门氏菌属Salmonella spp.和芽孢杆菌Bacillus等。利用基于MS的蛋白质组学技术直接对该类病原微生物蛋白质或特定的蛋白质标记物进行定性定量检测，可快速筛查水产品中致病微生物及其代谢产物产生的潜在危害。Fagerquist等［31］在利用MALDI-TOF-TOF MS及MS-MS技术对微生物蛋白质鉴定后，开发了一种基于Web的微生物蛋白质生物标记物快速识别软件，通过待测样品的MSMS离子碎片与在线基因组学数据库中的微生物蛋白质序列的比对确定微生物种类。Böhme等［32］采用MALDI-TOF MS技术，鉴定了26株从鲜鱼及经过热处理与真空包装的水产制品中分离的菌株，并建立质谱指纹图谱库，通过比较待测菌株与指纹图谱库，成功鉴定了病原微生物种类，这与 16S rRNA基因亲缘分析验证结果一致。

3.2过敏原检测

食物过敏是饮食健康的一个主要问题，众所周知，鱼类和甲壳类水产品是引起大多数成人食物过敏反应的主要过敏原，因此，亟需一种合适的分析技术来检测水产品中的过敏原，而基于MS的蛋白质组学技术可准确检测水产品中的蛋白质过敏原。Di Girolamo等［33］综述了蛋白质组学在食品过敏原中的应用，将其形象地称为食品过敏原组学 （food allergenomics）。蛋白质组学技术在食品过敏原中的主要应用有：探明免疫反应机理、开发新型过敏原诊断及预测方法、评价因食品加工过程中发生翻译后修饰作用引起的过敏特性变化等。Rosmilah等［34］利用蛋白质组学技术发现了长尾金枪鱼Thunnus tonggol中除小清蛋白以外的两种热分解蛋白过敏原 （肌酸激酶与烯醇酶）。此外，还有文献报道了利用该技术筛选了尼罗尖吻鲈Lates niloticus、鳕和北极虾Pandalus borealis中的蛋白过敏原［35-36］，为该类水产品质量安全控制提供了理论基础。

3.3原料鉴别

据相关报道［37］，2013年1月中旬，英国和爱尔兰的部分超市中出售的牛肉产品中掺杂了马肉和其他肉类，该事件逐渐扩大波及欧盟16个国家，引起人们对食品原料种类鉴定的重视。同样，水产品原料种类的鉴定亦成为水产品品质及质量安全研究的一个重要领域。目前，多数国家已颁布实施了相关规定，明确水产品原料应如实标识并禁止相近原料种类替换。传统的水产品原料种类鉴定常采用形态学及解剖学分析法，而此类方法很难用于种类接近尤其是经过加工处理破坏其初始形态的原料鉴定。为区分7种极其相似的虾类，Ortea等［38］在样品制备过程中采用高强度超声处理技术来提高胰蛋白酶分解肌浆蛋白的速度，然后采用蛋白质组学方法，并结合LC进行分离，用选择性串联质谱离子检测技术鉴定肽段，最终在90 min内完成了准确鉴定。Pepe等［39］采用蛋白质组学分析方法鉴别了北方蓝鳍金枪鱼 Thunnus thynnus、黄鳍金枪鱼T.albacares和长鳍金枪鱼T.alalunga。通过2-DE与质谱分析结合的方法可对鱼类物种特性肌肽进行鉴定：Piñeiro等［40］鉴别了欧洲无须鳕 Merluccius merluccius、澳洲无须鳕M.australis、阿根廷无须鳕M.hubbsi、智利无须鳕 M.gayi和南非无须鳕M.capensis；Barik等［41］鉴别了月尾鱯Sperata seenghala与剑鳠S.aor；而Carrera等［42］则是通过对小清蛋白片段的分析鉴别了10种无须鳕科Merlucciidae鱼类。此外，还有关于水产品原料种类的蛋白质组学鉴定方法的综述报道［43］。

4　展望

作为新兴领域的蛋白质组学研究发展速度极快，这主要是由于蛋白质组学技术可对蛋白质进行整体分析，较基因分析可更直接探明蛋白质的功能及规律［44］，高通量的蛋白质组学方法能够增加生理、育种、捕获、贮藏和加工方法对水产品影响的认识。蛋白质组学技术应用的一些局限性来自于蛋白质组的不稳定、蛋白质数量的巨大和可能的翻译后修饰，用2-DE法检测低丰度和高酸性或碱性蛋白质重现性较差，这些都使得一个样品中的蛋白质不能被完全鉴定出。此外，由于水产品蛋白质具有分子量较大、溶解度较低、存在高丰度蛋白质异构体和低离子化水平等局限性，导致目前蛋白质组学技术在水产食品营养方面的研究受到限制［5，45］。在蛋白质组学诸多研究技术中，蛋白质微阵列技术可高通量、平行化检测蛋白质在表达及翻译后修饰的变化，并具有灵敏度高、重现性好、定量准确等优点，具有较好的发展前途［46］。

蛋白质组学技术需要与其他组学方法相结合，如基因组学、转录组学、代谢组学等，加上生物信息学工具的帮助，从而系统地研究海洋生物的生物进程，控制和提高水产品的生产，保证食品质量和安全；另一方面，水产品种类的复杂性、生物多样性和序列的短缺是在短时期内实施组学策略的一个难题，只有不断增加和完善水产品基因及蛋白质数据库，才能更好地利用蛋白质组学进行各类研究，如生物机制、功能、性质等方面。蛋白质组学方法通过对蛋白质的分离、定性鉴定或定量检测，以及对蛋白质的结构和功能的分析，为水产品的质量与安全研究提供了一定借鉴。随着科技的进步，科学研究的不断深入，各种操作简便、重复性好的新技术的出现及数据库的完善，蛋白质组学必将在水产品研究中扮演越来越重要的角色。

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中图分类号：S98；Q503

文献标志码：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.03.020

文章编号：2095-1388（2016）03-0344-07

收稿日期：2016-02-25

基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项 （CARS-49）；国家自然科学基金资助项目 （31401563，31271957）；国家 “十二五”科技支撑计划项目 （2015BAK36B06，2015BAD17B03）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 （2014TS06）；广东省渔业科技推广专项 （Z2014001，Z2015007）

作者简介：赵永强 （1985—），男，博士，助理研究员。E-mail：zhaoyq@scsfri.ac.cn

通信作者：李来好 （1963—），男，博士，研究员。E-mail：laihaoli@163.com研究主要工作流程如图1所示。

Application of proteomics in regulation of aquatic products quality and safety：a review

ZHAO Yong-qiang1，LI Na1，2，LI Lai-hao1，YANG Xian-qing1，HAO Shu-xian1，WEI Ya1，CEN Jian-wei1
（1.Key Laboratory of Aquatic Product Processing，Ministry of Agriculture，National Research&Development Center for Aquatic Product Processing，South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300，China；2.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

Abstract：In order to carry out proteomics studies in terms of aquatic products quality and safety control，the main proteomics research technologies and typical workflows were firstly reviewed.Then，the growth environment，captured methods，feed composition，as well as processing and storage methods were discussed in this paper to evaluate the applications of proteomics in the field of aquatic products quality studies.Identification of pathogenic microorganisms，allergen detection and aquatic products materials authentication were listed in aquatic products safety studies section.At the end，the problems such as low reproducibility of two dimensional electrophoresis，as well as the limitations caused by high molecular weight，low molecular weight and low ionization levels of aquatic products protein were discussed.Besides，development of new proteomics research technologies，combination of proteomics methods and consummation of gene and protein data base were also prospected in this paper.This review could offer reference for the proteomics researchers engaged in aquatic products.

Key words：aquatic product；proteomics；quality and safety