益微微生物菌剂对乙草胺油菜药害的缓解效果及作用机制初步研究

陈 然，江 慧，李 黎，李俊凯

(长江大学 农学院，湖北 荆州 434025)

益微微生物菌剂对乙草胺油菜药害的缓解效果及作用机制初步研究

陈 然，江 慧，李 黎，李俊凯*

(长江大学 农学院，湖北 荆州 434025)

为了探索益微微生物菌剂拌种缓解乙草胺油菜药害的效果及其作用机制，采用盆栽法测定了益微拌种对乙草胺油菜药害的缓解效果，采用分光光度法分别测定益微拌种对油菜叶片中还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量和谷胱甘肽转移酶(GST)活性的影响，并采用GC-MS法检测油菜植株中乙草胺的残留量。结果表明：乙草胺的施用量为840～1 680 g/hm2时，对油菜生长均有一定的抑制作用；用益微拌种处理后，均能显著缓解乙草胺对油菜的药害，当乙草胺用量为1 680 g/hm2、拌种量为25 g益微拌1 kg油菜种子时，油菜的株高、鲜质量恢复率分别为79.31%和178.57%。与单用乙草胺处理相比，先用益微拌种后喷施乙草胺，油菜植株中GSH含量增加，GST活性提高，同时乙草胺残留量极显著降低。说明益微微生物菌剂能提高植株中相关抗逆酶的活性，促进乙草胺的降解，从而显著缓解乙草胺对油菜的药害。

乙草胺； 油菜； 药害； 微生物菌剂； 益微； 缓解效果； 作用机制

近年来由于劳动力成本的不断升高，我国冬油菜种植模式逐渐由人工移栽向直播转变，油菜田的杂草发生特点也发生了较大变化，严重危害油菜生产。除草剂的使用在控制油菜田杂草发生及危害方面起着重要的作用，特别是播后苗前土壤封闭处理成为直播油菜田杂草防除的关键技术[1-2]。目前酰胺类除草剂是油菜田应用较广泛的除草剂种类，其中乙草胺、异丙甲草胺常用于油菜播后苗前的土壤封闭以防除直播油菜田杂草[3-4]。乙草胺活性高、应用范围广，但使用量、使用方式、土壤湿度等对药效的发挥有较大的影响，特别是用药量过大或施药后遇持续低温高湿天气时，易对油菜产生药害[5-6]。目前国内外缓解除草剂药害的主要手段是应用除草剂安全剂[7-9]。然而，遗憾的是目前除草剂安全剂主要应用在预防除草剂对单子叶作物的药害方面，而用于预防除草剂对双子叶作物产生的药害鲜有报道[10-11]。微生物菌剂益微是将植物中分离得到的有益微生物制成的植物微生态制剂，其能在植物体内形成有利于植物生长的微生态环境，具有促进植物生长、增强植物抗逆性的功能。本研究以微生物菌剂益微为供试材料，通过拌种处理，在盆栽试验条件下，探索油菜免遭乙草胺药害的保护措施，并试图探明其缓解药害的机制，旨在为大田生产中乙草胺药害的补救提供理论依据和借鉴措施。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试作物：中双4号油菜(BrassicacampestrisL.)，其种子购自湖北荆楚种业股份有限公司。

药剂及试剂：益微微生物菌剂(枯草芽孢杆菌≥300×108cfu/g，胶冻样类芽孢杆菌≥0.02×108cfu/g)，河北微生物技术有限公司提供；50%乙草胺乳油，山东胜邦绿野化学有限公司生产；三氯乙酸(TCA)，天津市北联精细化学有限公司生产；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，国药集团化学试剂有限公司生产；2,4-二硝基氯苯(CDNB)，西亚试剂公司生产；5,5-二硫代双乙硝基甲酸(DTNB)、还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽还原酶(GR)、NADPH均为Sigma公司产品；乙草胺标准品来自国家标准样品发行中心；甲醇、石油醚、乙酸乙酯、氯化钠均为分析纯。

试验仪器：FA2004电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)、紫外分光光度计UV3200S(上海美谱达仪器有限公司)、离心机(德国Eppendorf 5810R)、7890A GC-5975C MS(安捷伦科技有限公司，配有EI离子源、自动进样器)、Florisil固相萃取柱(美国Agilent公司)。

1.2.1 盆栽法测定益微微生物菌剂对乙草胺油菜药害的缓解效果 在塑料盆中加入定量过筛的风干土，并用一定水量将其浸湿，分别用25 g益微微生物菌剂拌3 kg、1 kg油菜种子，并播于已装土的塑料盆中，同时设未经益微微生物菌剂处理的种子为空白对照(CK)，每盆25粒，每处理重复3次，覆盖1 cm土，放于网室中。播种后1 d用0、840、1 260、1 680 g/hm2的乙草胺喷雾进行土壤封闭，播后10 d测定株高、单株鲜质量，计算乙草胺对油菜的抑制率、益微微生物菌剂单独使用对油菜的促长率、益微微生物菌剂对油菜的恢复率。计算公式如下：

抑制率=(空白处理值-乙草胺单剂处理值)/空白处理值×100%

促长率=(益微单剂处理值-空白处理值)/空白处理值×100%

恢复率=(益微乙草胺处理值-乙草胺单剂处理值)/(空白处理值-乙草胺单剂处理值)×100%。

1.2.2 GSH、GSSG(氧化型谷胱甘肽)和GST(谷胱甘肽转移酶)的提取和测定 播后10 d，取0.5 g新鲜油菜叶片，按照参考文献[12-13]的方法对GSH、GSSG含量和GST活性进行测定。

1.2.3 油菜中乙草胺含量的测定

1.2.3.1 提取与纯化 在油菜播后第10天，称取5 g待测样品(整株油菜)于50 mL离心管中，加入20 mL甲醇，超声提取3 min，再加入5 g氯化钠震荡3 min，5 000 r/min下离心3 min，取上清液10 mL于圆底烧瓶中，旋干，加入淋洗液(乙酸乙酯∶石油醚=1∶9)溶解。用5 mL石油醚活化固相萃取柱，加入待分离样品，再加淋洗液20 mL，收集20 mL液体，旋干待测。

护理人员是经过专业的护理学校毕业,通过专业的考试并领有执照的医务工作者。由于护理人员的工作与人们的健康,甚至生命息息相关,所以要求护理人员不仅要具有完备的专业素质,更要有健康的身体和良好的心理素质。伴随着科学技术水平的提高,人类对健康和疾病的思考也发生了相应的改变,致使医学模式也发生了大转变,医疗事业也是飞速发展,与此同时,护理工作日益展现出其重要的作用与地位。护理工作要求高、责任重、操作多、工作量超负荷、上班时间没有规律是护理工作的一大特点。据报道,护理工作压力明显高于一般职业,护理人员身心健康水平远低于普通职业人群。

1.2.3.2 色谱条件 采用HP-5石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。载气:He，1.0 mL/min，恒流；柱温:90 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至150 ℃，保持4 min，以4 ℃/min升至200 ℃，保持8 min，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持2 min；进样口温度：250 ℃；接口温度：280 ℃；进样方式：不分流进样；进样量:1 μL；四极杆温度:150 ℃；离子源温度:230 ℃；电子能量：70 eV；数据采集模式：选择离子监测(SIM)，选择离子为m/z 162、174、234、269，m/z 162为定量离子，其他均为定性离子[14-15]。

2 结果与分析

2.1 益微微生物菌剂对油菜生长的影响

从表1可以看出，益微微生物菌剂单独处理条件下，当25 g益微微生物菌剂拌种1 kg油菜种子时，对油菜的株高和单株鲜质量有显著的促进作用，促长率分别为14.07%和28.75%；当25 g益微微生物菌剂拌种3 kg油菜种子时，对油菜的株高和单株鲜质量无显著的促进作用。

表1 益微微生物菌剂对油菜生长的影响

注：同列不同小、大写字母分别表示不同拌种量处理间差异显著(P<0.05)、极显著(P<0.01)，下同。

2.2 盆栽条件下益微微生物菌剂拌种对乙草胺油菜药害的缓解效应

如表2所示，在盆栽条件下乙草胺使用量为840、1 260、1 680 g/hm2时，其对油菜株高的抑制率分别为31.11%、37.04%、42.96%，对单株鲜质量的抑制率分别为13.75%、20.00%、17.50%，表现出对油菜植株的药害效应。益微微生物菌剂拌种处理对乙草胺在油菜株高和单株鲜质量方面产生的药害均有显著的缓解作用，且在相同的乙草胺用量下，不同用量的益微微生物菌剂对油菜的缓解效果存在差异。当25 g益微微生物菌剂拌种1 kg油菜种子时，对各使用量(840、1 260、1 680 g/hm2)的乙草胺药害缓解效果最明显，油菜株高的恢复率分别为32.14%、46.67%、79.31%，油菜单株鲜质量的恢复率分别为190.91%、168.75%、178.57%。

表2 盆栽条件下益微微生物菌剂拌种对乙草胺油菜药害的缓解效应

2.3 益微微生物菌剂对油菜GSH、GSSG含量及GST活性的影响

如表3所示，单独用益微微生物菌剂拌种，可提高油菜叶片中GSH含量；单独使用乙草胺喷雾处理，可显著降低油菜叶片中GSH含量。而经过益微微生物菌剂拌种处理后再喷施乙草胺，与单独喷施乙草胺相比，均增加了油菜叶片中GSH含量，在3种不同使用量的乙草胺条件下，益微微生物菌剂25 g拌1 kg油菜种子时，油菜叶片中GSH含量均显著或极显著增加。

单独用益微微生物菌剂拌种，低用量增加油菜叶片中GSSG含量，高用量降低油菜叶片中GSSG含量。单独使用乙草胺喷雾，可增加油菜叶片中GSSG含量，而用益微微生物菌剂25 g拌1 kg油菜种子时，均显著或极显著降低GSSG含量。

单独用益微微生物菌剂拌种，可提高油菜叶片中GST活性。单独使用乙草胺喷雾，可减低油菜叶片中GST活性，而经过益微微生物菌剂不同用量处理后再喷施乙草胺均提高了油菜叶片中GST活性，在益微微生物菌剂25 g拌1 kg油菜种子时，乙草胺3个使用量的油菜叶片中GST活性均显著或极显著提高。

表3 益微微生物菌剂对油菜GSH、GSSG含量及GST活性的影响

2.4 乙草胺标准曲线

将乙草胺标准溶液在前述色谱条件下进行测定，保留时间为20.609 min，以峰面积对质量浓度进行线性回归，在0.05～5.0 mg/L范围内质量浓度与峰面积呈现良好的线性相关，线性方程为：Y=280 388X-33 879(R=0.995 8)。说明该色谱条件满足乙草胺定量分析的需要。

2.5 乙草胺测定方法的回收率与精密度

在不含乙草胺的空白油菜样品中加入定量(0.1～1.0 mg/L)的乙草胺标准品，按1.2.3中方法进行提取纯化并测定油菜样品中的乙草胺含量，计算回收率。结果表明，平均回收率为83.2%～101.0%，相对标准偏差(RSD)小于6.3%(表4)。

表4 乙草胺添加回收率测定结果

2.6 油菜中乙草胺的残留量

在播后10 d检测油菜中乙草胺的残留量，从表5可以看出，25 g益微微生物菌剂拌种3 kg和1 kg条件下，乙草胺使用量为840 g/hm2时油菜植株中乙草胺残留量分别减少36.84%和31.58%，乙草胺使用量为1 260 g/hm2时油菜植株中乙草胺残留量分别减少30.77%和34.62%，乙草胺使用量为1 260 g/hm2时油菜植株中乙草胺残留量分别减少48.57%和45.71%，表明使用益微微生物菌剂拌种处理能够显著降低油菜中乙草胺残留量。

表5 油菜中乙草胺的残留量 mg/kg

3 结论与讨论

GSH的主要生理功能是清除植物在逆境下体内产生并积累的过量活性氧，以维持活性氧的正常平衡，从而保护植物免受活性氧引起的伤害。它是生物细胞中普遍存在的一种具有特殊功能的多肽，在生物的许多代谢生理过程中起到重要的作用。而GSH和GSSG在植物体内通常处于稳恒性动态平衡，即当机体内积累较多的GSSG时，GSH还原酶将GSSG还原成GSH。在该生化反应中，GSSG本身无清除自由基作用，只参与维持2种形态谷胱甘肽的动态平衡，除此之外，还可能参与其他生化反应。目前已有研究发现，除草剂安全剂可以提高植物中GSH含量，达到解毒的目的[16-17]。

GST是一类胞质酶，能催化GSH经半胱氨酸的硫原子与多种疏水化合物亲电基团的连接作用，这种作用是生物体进行脱毒和排毒的重要方式。GST在植物体抵御外源物质伤害及对多种逆境的抗性中起着重要的作用。研究发现，GST可以催化GSH与乙草胺的轭合反应，加速乙草胺的代谢，从而进行解毒[18-19]。

本研究表明，乙草胺对油菜幼苗的株高、鲜质量和油菜叶片中的GSH含量、GST活性都有抑制作用，随着乙草胺用量的增加，抑制作用加强，而对GSSG含量有促进作用，随着乙草胺用量的增加，促进作用加强。在用25 g益微微生物菌剂拌1 kg油菜种子时，油菜的株高、鲜质量和油菜叶片中的GSH含量、GST活性均有不同程度的提高，油菜叶片中GSSG含量和乙草胺的残留量减低；在相同的乙草胺用量下，益微微生物菌剂各用量处理之间的解毒效果存在差异，用25 g益微微生物菌剂拌1 kg油菜种子时，对油菜的保护效果最好。这说明高用量的益微微生物菌剂会刺激和促进作物的生长。益微微生物菌剂能够提高油菜植株中GST活性和GSH含量，并减低GSSG含量和乙草胺残留量，从而缓解乙草胺对油菜幼苗产生的药害，表明使用益微微生物菌剂拌种是减轻乙草胺对油菜药害的有效措施之一。

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Curing Effect of Antidote Yiwei on Rape Injury Caused by Acetochlor and Its Functional Mechanism

CHEN Ran,JIANG Hui,LI Li,LI Junkai*

(College of Agriculture,Yangtze University,Jingzhou 434025,China)

In order to study the mitigation effect of the microbial agent Yiwei on acetochlor herbicide injury to rape,and its preliminary mechanism,the curing effect of Yiwei as a seed-dressing agent was studied by pot growing method.The contents of glutathione(GSH),oxidized glutathione(GSSG) and the activity of glutathione S-transferase(GST) in rape leaf were measured by UV-Vis and the residue of acetochlor in rape was determined by GC-MS.The results showed that when acetochlor was applied with concentration of 840—1 680 g/ha,it inhibited the growth of rape.Yiwei as a seed-dressing agent could remarkably ease this injury caused by acetochlor.When 25 g Yiwei was used to deal with 1 kg rape seed,the recovery ratios of rape seedling height and fresh weight from the injury caused by 1 680 g/ha acetochlor were 79.31%,178.57% respectively.Compared with the rape seedlings injured by acetochlor alone, Yiwei could increase the content of GSH,outstandingly enhance the activity of GST,and reduce the residue of acetochlor in rape seedlings.It turned out that Yiwei could improve activities of related enzymes such as GST and accelerate the degradation of acetochlor residue in rape seedlings to cure rape injury caused by acetochlor.

acetochlor; rape(BrassicacampestrisL.)； phytotoxicity； microbial agent; Yiwei； curing effect; mechanism

2015-11-04

公益性行业(农业)科研专项(201203098);国家自然科学基金项目(31371976)

陈 然(1990-)，男，湖北洪湖人，在读硕士研究生，研究方向：植物保护。E-mail：changdachenran@163.com

*通讯作者：李俊凯(1969-)，男，湖北荆门人，教授，博士，主要从事新农药开发与农药环境毒理研究。E-mail：junkaili@sina.com

S482.4+6;S451.22+3

A

1004-3268(2016)05-0082-05