湖南省洞庭湖区5株H6N6亚型禽流感毒株HA、NA基因的遗传进化分析

宋跃君，谭 丹，，邓国华，王昌建，朱春霞，张朝阳，刘道新，黄建龙（.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙4004；.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨5000）



湖南省洞庭湖区5株H6N6亚型禽流感毒株HA、NA基因的遗传进化分析

宋跃君1，谭 丹1，2，邓国华2，王昌建1，朱春霞1，张朝阳1，刘道新1，黄建龙1
（1.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙410014；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001）

摘 要：为了从分子生物学角度了解H6N6亚型禽流感病毒在湖南省洞庭湖区的变异特点和进化规律，为该地区H6N6亚型禽流感的防控提供一些理论依据，对2012年在洞庭湖区分离的H6N6亚型禽流感毒株的HA、NA基因进行扩增、克隆和测序，并对所得序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示，本试验分离到的5株H6N6亚型禽流感毒株HA裂解位点为PQIETR↓GLF，均没有多个连续的碱性氨基酸插入，属于低致病性病毒；5株病毒的HA和NA潜在的糖基化位点有一些差别，这些差别是否会引起其毒力和致病力上的差异还有待研究；从基因遗传进化关系来看，这些毒株与我国汕头、广西分离的毒株同源性较高。

关键词：H6N6亚型禽流感；同源性；遗传进化

禽流感是由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的一种禽类（家禽和野禽）传染病［1］，禽流感病毒（AIV）根据致病力的不同可以分为高致病性禽流感病毒、低致病性禽流感病毒和无致病性禽流感病毒。 H6亚型AIV最早分离于鸭，后来发现也能够传播给鸡和鹅，可在不同宿主之间跨种传播。近年来，H6亚型AIV在我国和其他一些国家及地区的野鸟和家禽中广泛存在，其流行和传播呈上升趋势。2000年以来，H6亚型低致病性禽流感

1　材料

1.1毒株

5株H6N6亚型AIV均来自湖南省洞庭湖区活禽市场及鸭场的正常监测样品，由哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室分离保存，病毒命名为：A/DK/HuN/S1661/2012（H6N6）、A/DK/HuN/ S12223/2012（H6N6）、A/DK/HuN/S12236/2012 （H6N6）、A/DK/HuN/S12320/2012（H6N6）、A/EN/ HuN/S12267/2012（H6N6）。

1.2SPF鸡胚

9～11日龄SPF鸡胚购自哈尔滨兽医研究所动物实验动物中心。

2　方法

2.1病毒的增殖

将供试AIV按104～109梯度稀释度接种10日龄SPF鸡胚，48 h后取有血凝价（HA-HI试验）且病毒稀释度最高的鸡胚尿囊液作为下一次纯化种毒，如此纯化3次后，以最适合的稀释度接种9～11日龄SPF鸡胚，48 h后收取鸡胚尿囊液，经过HA-HI试验验证及无菌检测后分装，-70 ℃保存备用。

2.2PCR扩增及产物的回收

根据GenBank中H3N8亚型AIV各基因片段序列选择同源性最高的区域设计引物。PCR扩增后，PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像系统分析鉴定结果，然后按照试剂盒说明书进行PCR产物回收。

2.3HA和NA基因组序列的测定

利用紫外透射仪测定PCR产物的浓度并按测序要求计算所需DNA量，PCR反应结束后加入2.0μL的终止液。测序反应产物在终止反应后加入95%冰乙醇60μL，混匀，于-20℃放置15min后，4℃下12000r/min离心20 min，小心弃去上清，加70μL70%冰乙醇，4℃下12000 r/min离心10min洗脱残留的盐，之后再重复操作一次，倒于纸上，室温晾干，加入15μL甲酰胺，使DNA沉淀充分溶解，最后全部加入到测序板内，并进行高温变性，采用ABI测序仪进行测序。

2.4序列的拼接和分析

病毒各基因片段序列采用DNAStar软件中Seqman程序对测定的各个基因原始序列进行拼接，采用MegAlign程序对各个基因片段进行核苷酸以及氨基酸的同源性比较；应用Mega 5软件包对病毒各个基因进行多序列比对和进化树的绘制与分析。

3　结果

3.1HA基因序列分析及遗传进化分析

在洞庭湖区市场和鸭场监测样品中分离的5株H6N6亚型毒株的HA开放阅读框为1701，编码566个氨基酸。HA蛋白的裂解位点为PQIETR↓GLF，无多个连续碱性氨基酸的插入，属于低致病性病毒。5株病毒的糖基化位点除A/DK/HuN/S12223/2012（H6N6）、A/DK/HuN/ S/2320/2012（H6N6）两株毒没有182（NNT）位点之外，其余三株均有8个糖基化位点，分别为26、27、39、182、306、311、498和557。对5株病毒可能的受体结合位点进行分析发现，所有的位点均保守，未发生突变（表1）。

将这5株病毒的HA基因序列进行Blast比对，同源性在93.8%～99.6%之间。与2005年以后在我国汕头、广西分离的毒株及同期在越南鸭中分离的H6毒株均处于同一进化分支。5株毒与该分支中参考序列核苷酸的同源性在93.4%～98.5%之间，该分离的毒株与2003年在汕头野鸟中分离的病毒株A/Wild bird/Shantou/2853（H6N2）序列核苷酸同源性在93.8%～97.2%之间，与1997年在香港分离到的A/Teal/HongKong/W312/97（H6N1）毒株核苷酸的同源性在85.0%～87.2 %之间。从进化示意图1可以看出，2003年在汕头野鸟中分离的A/ Wild bird/Shantou/2853（H6N2）毒株比该分支其他毒株进化的更原始，可作为该分支的共同来源。

3.2NA基因序列分析及遗传进化分析

表1　H6N6亚型禽流感病毒HA基因特征位点氨基酸序列分析

图1　H6N6亚型禽流感病毒的HA基因进化树

对这5株H6N6亚型禽流感毒株的NV基因序列分析，发现其NA基因并没有颈部的缺失，但潜在的糖基化位点有一些差别，NA基因没有62 （NHT）、67（NFT）位点，其中有2株没有54 （NPT）位点（表2）。对其进行遗传演化分析，结果显示，5株H6N6亚型毒株与以往在我国其他地区分离的H6N6毒株处于同一分支，核苷酸同源性在93.3%～99.7%之间，说明本研究中的H6N6亚型毒株并没有NA基因的重组。从进化关系上看，分支中2005年从汕头野鸟中分离的H6N6毒株比其他毒株的进化关系更原始（图2）。

4　讨论

4.1HA是病毒毒力和宿主特异性的主要决定因素［7-8］，大多数高致病力毒株的HA在其裂解位点附近有多个碱性氨基酸插入，在无类胰蛋白酶的情况下就能发生裂解，造成感染禽全身系统衰竭死亡。分离的5株H6N6亚型禽流感毒株的HA裂解位点为PQIETR↓GLF，均没有多个连续的碱性氨基酸插入，属于低致病性病毒。HA上潜在的糖基化位点是影响AIV毒力的因素之一［9］，A/DK/HuN/S12320/2012（H6N6）、A/DK/HuN/ S12223/2012（H6N6）两株毒没有182（NNT）糖基化位点。在对SPF鸡致病性研究中发现，A/ DK/HuN/S12320/2012毒株不引起鸡泄殖腔排毒，是否是由于该糖基化位点的缺失而引起该毒株的毒力减弱还需进一步研究。

表2　H6N6亚型禽流感病毒NA基因特征位点氨基酸序列分析

图2　H6N6亚型禽流感病毒的NA基因进化树

4.2对HA、NA基因序列进行遗传演化分析，发现其与我国汕头、广西分离的毒株同源性较高。湖南洞庭湖地区是“东亚-澳大利亚迁徙线”候鸟和我国候鸟迁徙的主要停歇地，汕头、广西等地也处在“东亚-澳大利亚迁徙线”上。张玉稳［10］等人研究认为，H6亚型AIV主要宿主是野鸟，野鸟的迁徙对H6亚型禽流感的散播起到很大作用。罗维玉［4］等人认为H6亚型禽流感病毒为H5亚型禽流感病毒内部基因供体，其内部基因不停地在H6与H5两亚型之间传递和进化，造成对禽流感疫情的控制更加困难，因此对该地区进行长期监测研究，了解禽流感病毒的变异情况显得非常重要。

参考文献：

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［3］Woolcock P R，Suarez D L，Kuney D，et a1.Low-pathogenicity avian infl uenza virus（H6N2）in chickens in California，2000-02［J］.Avian Dis，2003，47（3）：872-881.

［4］罗维玉，胡永浩，邓国华，等.两株鹅源H6N2亚型禽流感广东分离株的全序列分析及致病性研究［J］.中国预防兽医学报，2012，34（5）：345-349.

［5］陈妍梅，葛万运，黄川，等. 广西健康青年H9、H6亚型禽流感病毒血清抗体调查［J］.中国热带医学，2008，8（6）：985-986.

［6］Gillim-Ross L，Santos C，Chert Z，et a1.Avian influenza h6 viruses productively infect and cause illness in mice and ferrets［J］.J Virol，2008，82（21）：10854-10863.

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［8］陈思怀，乔宪凤，华文君，等. H6N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及其序列分析［J］.西南农业大学学报（自然科学版），2006，28（5）：846-849.

［9］Michael L P，John W L，John M C. A novel carbohydrate addition site on the hemagglutinin protein of fl highly pathogenic H7 subtype avian infl uenza virus［J］.Virology，1995，213：276-283.

［10］张玉稳，柴洪亮，张苗，等. 一株野鸭源H6N1亚型禽流感病毒HA基因的克隆及分子进化分析［J］.野生动物，2010，31 （6）：327-330.

（责任编辑：朱迪国）

中图分类号：S851.3

文献标识码：B

文章编号：1005-944X（2016）01-0009-04

通讯作者：黄建龙在美国多次暴发，从散养的家禽和商品鸡中均可分离出AIV［2-3］。H6亚型也是我国流行病学调查过程中分离数量最多的AIV之一，占所有AIV亚型的17.8%［4］。有报道称H6亚型AIV不仅可以向H5亚型高致病性AIV和H9N2亚型AIV提供内部基因片段，而且还可以感染鼠、水貂和人［5-6］。AIV基因组中变异最频繁的是HA、NA基因，HA是决定病毒致病性、毒力强弱和宿主特异等方面的关键因素之一。禽流感毒株HA、NA基因的频繁变异给禽流感的防控带来非常大的难度。本研究对2012年湖南省洞庭湖区活禽市场及鸭场的正常监测样品中分离到的5株H6N6亚型禽流感毒株进行HA、NA基因遗传进化分析，旨在从分子生物学角度了解H6N6亚型AIV在湖南省洞庭湖区的变异特点和进化规律，为该地区H6N6亚型禽流感的防控提供一些理论依据，从而有效预防和控制禽流感，保护人体健康和公共卫生安全。

Genetic Evolution of HA and NA Genes of Five Isolates of H6N6 Subtype AIV in Dongting Lake Area

Song Yuejun1，Tan Dan1，2，Deng Guohua2，Wang Changjian1，Zhu Chunxia1，Zhang Chaoyang1，Liu Daoxin1，Huang Jianlong1
（1.Hunan Provincial Animal Disease Prevention and Control Center，Changsha，Hunan 410014；2.Animal Infl uenza Laboratory of the Ministry of Agricultural，State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology，Harbin Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Harbin，Heilongjiang 150001）

Abstract：In order to explore the genetic variation characteristics and evolution of H6N6 subtype AIV，and provide some theories about prevention and control of H6N6 subtype AIV in Dongting Lake area of Hunan province，fi ve isolates of H6N6 subtype AIV were isolated in the region in 2012，then HA and NA genes were sequenced，and their homology and genetic evolution were analyzed . The result showed that the fi ve strains of H6N6 subtype AIV belonged to low pathogenic avian infl uenza virus，because their cracking sites all were not inserted by some continuous alkaline amino acid. There were some differences about HA and NA potential glycosylation sites which may cause the difference of its virulence and pathogenicity，but this still needs to be studied. From phylogenetic tree of gene，the fi ve strains has high homology with some strains isolated from Shantou and Guangxi.

Key words：H6N6 AIV；homology；evolution