RACK1对肺腺癌A549细胞生物学行为及相关蛋白表达的影响

杜凯丽 梁 钢 康继辉 米小芳 王宏坤 肖 虹 梁建芳 郑绘霞



RACK1对肺腺癌A549细胞生物学行为及相关蛋白表达的影响

杜凯丽 梁 钢 康继辉 米小芳 王宏坤 肖 虹 梁建芳 郑绘霞

【摘要】目的 研究RACK1基因沉默对A549细胞生物学行为的影响，探究其对VEGF、Bcl-2表达的影响。方法 转染RACK1 shRNA至A549细胞，分别设稳定转染的实验组、阴性对照组和空白对照组。Western blot检测各组细胞RACK1、VEGF、Bcl-2的表达，平板克隆实验检测各组细胞的增殖情况，划痕愈合实验观察细胞运动迁移的改变，流式细胞术分析细胞凋亡率的变化。结果 实验组细胞增殖能力下降，迁移能力减弱，凋亡率增高，VEGF、Bcl-2表达下调（P＜0．05）。结论 RACK1基因沉默能抑制A549细胞的增殖和迁移，诱导其凋亡，下调VEGF、Bcl-2的表达。

【关键词】RACK1；shRNA干扰；流式细胞术

Objective To investigate the effect of silencing RACK1 on A549 cell proliferation and VEGF，Bcl-2 expression． Methods The shRNA was transfected into A549 cells as the experiment group． The expression level of RACK1，VEGF，Bcl-2 were measured by western blot，cell proliferation was detected by plate colony forming assay． scratch healing experiment was used to detet migration capacity． Cell apoptosis was measured by flow cytometry． Results The ability of proliferation and the migration ability of the cells in the experimental group was weakened． The apoptotic rate was increased． The expression level of VEGF and Bcl-2 were decreased． Conclusion Targeting to inhibit RACK1 expression in A549 cells could inhibit proliferation and induce apoptosis，specifically decreased the expression level of VEGF and Bcl-2．

【Key words】 RACK1，ShRNA interference，Flow cytometry

肺腺癌发病隐匿，多数患者常以转移灶为首发症状，生存率极低［1］。RACK1在肺腺癌中表达增高，与患者的病理分期、肿瘤大小、淋巴结转移状况有相关性［2］。本研究通过沉默肺腺癌A549细胞中RACK1的表达，观察干扰前后细胞的生长、迁移、细胞周期及凋亡状况，探讨RACK1在肺腺癌细胞中发挥的作用及其与VEGF和Bcl-2之间可能存在的关系。

1 实验方法

1.1 细胞的转染

待细胞达到60%～70%融合时，转染RACK1 shRNA至A549细胞，以转染空载质粒作为阴性对照组，以未转染的细胞作为空白对照组。

1.2 Western blot检测各组细胞RACK1、VEGF、Bcl-2的表达

取转染48 h后的各组细胞蛋白样品经1电泳分离后转膜，封闭后一抗、二抗4℃孵育，发光显影。目的蛋白与内参GAPDH灰度值标比后的比值为其相对蛋白表达量。

1.3 平板克隆形成实验

将各组细胞在6 cm培养皿中连续静置培养14 d。4%多聚甲醛固定，姬姆萨染液染色，自来水冲洗、晾干，显微镜下记录克隆数。

1.4 体外迁移实验

待细胞生长达到90%左右融合时进行划痕处理，于划痕后0 h、24 h、48 h观察拍照，划痕愈合率（%）=（1-各时间点划痕面积/开始的划痕面积）×100%，愈合率反应各组细胞的体外迁移能力。

1.5 细胞凋亡率检测

将各组细胞用PBS液洗涤后200目筛网过滤，按照Annexin-V说明书滴加试剂，30 min内用流式细胞仪检测。

1.6 统计学分析

2 结果

经比较，实验组细胞RACK1蛋白相对表达量降低（P＜0.05），增殖、迁移能力减弱，凋亡率增高，VEGF、Bcl-2表达下调（P＜0.05），见表1。

表1 RACK1对A549细胞增殖、迁移、凋亡及相关蛋白表达的影响

3 讨论

有学者认为RACK1是肺腺癌特异的分子生物学标记物［2］，其表达水平的改变可能直接影响到肺腺癌的进展情况。我们前期研究通过分析RACKl和VEGF在肺腺癌组织中的表达情况，发现这两种蛋白在肺腺癌的浸润转移过程中可能以相互协同促进的方式发挥作用［3］。本次研究发现，沉默RACK1基因后A549细胞的增殖能力和迁移能力均下降，同时VEGF的表达也降低，这说明RACK1可能通过某种途径发挥了对VEGF的调控，从而调控了肺腺癌细胞的增殖和迁移能力。同时沉默RACK1基因后A549细胞的凋亡率增加，Bcl-2的表达降低，因此我们推测RACK1可能在Bcl-2上游发挥了一定的调控作用，通过上调Bcl-2而抑制细胞凋亡。有学者证实RACK1参与了SHH和STAT3信号通路的激活［4］，从而导致细胞异常增殖和恶性转化，而VEGF、Bcl-2均为STAT3和SHH信号通路下游的靶基因，有学者发现STAT3的激活可以诱导VEGF的表达和活性增强［5］，在肺腺癌中STAT3的活化能增强Bcl-2的表达，从而显示出其抗凋亡效应［6］，有文献报道SHH信号通路与VEGF的表达存在相关性［7］，Yang等［8］学者发现SHH过表达的肺腺癌细胞增殖能力增强且凋亡水平降低，且Bcl-2的表达水平也上调。由此我们猜测在肺腺癌中RACK1可能通过对SHH和STAT3信号通路的调控而影响了VEGF、Bcl-2的表达，但具体分子机制如何，尚待进一步研究说明。

参考文献

［1］ Little AG，Gay EG，Gaspar LE，et al． National survey of non-small cell lung cancer in the United States: epidemiology，pathology and patterns of care［J］． Lung Cancer，2007，57（3）: 253-260．

［2］ Naqashio R，Sato Y，Matsumoto T，et al． Expression of RACK1 is a novel biomarker in pulmonary adenocarcinomas［J］． Lung Cancer，2010，69（1）: 54-59．

［3］ 杨静． RACK1、VEGF、SOX-2和p40蛋白在非小细胞肺癌中的表达及意义［D］． 太原:山西医科大学，2014．

［4］ Shi S，Deng YZ，Zhao JS，et al． RACK1 promotes NSCLC tumorigenicity through activating SHH signaling pathway［J］． J Biol Chem，2012，287（11）: 845-858．

［5］ 赵敏． 肺癌组织芯片中STAT3，Bcl-2和VEGF表达的生物学意义及相关分子机制的研究［D］． 天津:天津医科大学，2006．

［6］ 闫凌丽，王鸿程，朱晨． STAT3信号转导途径在肺腺癌细胞中的表达活化［J］． 细胞与分子免疫学杂志，2009，25（2）: 141-142．

［7］ 马晓丽，孙海基，汪运山，等． 胃癌组织中Sonic Hedgehog和vegf表达及临床意义的研究［J］． 中华肿瘤防治杂志，2007，14（24）: 1879-1881．

［8］ Yang Q，Shen SS，Zhou S，et al． STAT3 activation and aberrant ligand-dependent SHH signaling in human pulmonary adenocarcinoma［J］． Exp Mol Pathol，2012，93（2）: 227-236．

The Effect of RACK1 on the Biological Behavior of Lung Adenocarcinoma Cells A549 and VEGF，Bcl-2 Expression

DU Kaili LIANG Gang KANG Jihui MI Xiaofang WANG Hongkun XIAO Hong LIANG Jianfang ZHENG Huixia Basic Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

【Abstract】

作者单位：030001 太原，山西医科大学基础医学院 基金项目：山西省科技攻关项目（项目编号：20140313011-13）

通讯作者：郑绘霞，E-mail：huixiazheng62@126．com

【中图分类号】R361

【文献标识码】A

【文章编号】1674-9316（2016）05-0178-03

doi:10．3969/j．issn．1674-9316．2016．05．130