温度对14株无乳链球菌溶血价的影响

蒙爱云, 周永灿, 胡文婷, 吴梦晓, 王世锋, 谢珍玉, 郭伟良

(海南大学 海洋学院，海南省热带水生生物技术重点实验室，海南 海口 570228)



温度对14株无乳链球菌溶血价的影响

蒙爱云, 周永灿, 胡文婷, 吴梦晓, 王世锋, 谢珍玉, 郭伟良

(海南大学 海洋学院，海南省热带水生生物技术重点实验室，海南 海口 570228)

摘要：为了研究温度对无乳链球菌溶血价的影响，本文选择了来自不同地区、不同宿主和不同血清型的14株无乳链球菌，以2倍梯度稀释法分别测定了3个培养温度(25 ℃、30 ℃和37 ℃)对各菌株溶血价的影响，并测定了37 ℃下静置培养和振荡培养对各菌株溶血价的影响.结果表明，14株无乳链球菌的溶血价均显著受培养温度的影响，其中，有11株无乳链球菌的溶血价在37 ℃时最高、2株在25 ℃时最高、1株在30 ℃时最高，2015年分离自海南养殖场的5株罗非鱼源无乳链球菌的溶血价均在高温培养条件下较高.37 ℃下培养方式对无乳链球菌溶血价影响的研究结果表明，14株实验菌株中有12株的溶血价受振荡影响显著，其中，有8株实验菌株的溶血价在静置培养时比振荡培养时显著升高、有4株实验菌株的溶血价在振荡培养时比静置培养时显著升高.

关键词：无乳链球菌; 溶血价; 温度

无乳链球菌(Streptococusagalactiae)为革兰氏阳性菌，是唯一的B群特异性抗原链球菌(groupBstreptococcus，GBS).GBS可广泛地感染宿主，是人、畜、鱼共患的条件致病菌.GBS最初被确定为牛乳腺炎病原，之后因其能感染新生儿、婴儿、妇女和老人等，并引起他们患脑膜炎、脑水肿、脓毒血症和心内膜炎等疾病而广受关注[1-3]；19世纪80年代以来，人们陆续发现GBS还是危害严重的水生动物的病原，它可广泛感染淡、海水养殖动物，包括鲮鱼、卵形鲳鲹、虎纹蛙、红鳍东方纯、石斑鱼、美国红鱼和罗非鱼等，对水产养殖业造成严重危害[4-6].2009年以来，在我国各主要罗非鱼养殖区，GBS感染引起的链球菌病发病率达95%以上，累积死亡率达30%～80%，为我国当前罗非鱼养殖危害最严重的病害[7].已有研究表明，罗非鱼链球菌病的发生与温度密切相关，一般水温在26 ℃以上的开始发病，水温在30 ℃以上时病情加剧[8].近年来，国内外学者陆续在温度对GBS的侵染力、毒力、毒力相关基因的表达量、粘附活性和溶血活性等的影响方面进行了研究[9-15].其中，β-溶血素属于成孔毒素，可破坏细胞膜结构和扰乱其功能，造成细胞溶解，引起败血症等症状.此外，其在浸染表皮和内皮细胞以及激活宿主炎症介质中发挥着关键作用，是GBS最重要的毒力因子之一[16-18].已有研究表明，GBS的β-溶血素基因(cylE基因)表达量随温度的升高而显著上调[10,14]；但这些研究仅针对某个特定的分离菌株，据报道GBS在分子血清型和溶血特征等方面存在着多样性[19-21].为了解温度和培养方式对不同类型GBS溶血特性的影响，本文对14株不同地区、来源和血清型的GBS菌株在不同培养温度和培养方式下的溶血价进行了研究与分析，旨在了解GBS的溶血特性，并为防控GBS引起的疾病提供理论依据.

1材料与方法

1.1实验材料实验用14株GBS菌株的来源、分离时间和地区等信息见表1，所有菌株接种于脑心浸液(BHI)液体培养基，于30 ℃下，以180r·min-1振荡培养24h，加等体积φ=50%的无菌甘油，一份样品于-80 ℃保藏，另一份样品于-20 ℃保存，备用.

表 1　14株实验GBS菌株的来源、分离时间和地点

主要试剂：脑心浸液培养基(北京陆桥技术有限责任公司)(37g·L-1)；SDS(北京Solarbio科技有限公司)、肝素钠(北京Solarbio科技有限公司)(1 400U·mL-1).含氯化钠(8.0g·L-1)和氯化钾(0.2g·L-1)的0.01mmol·L-1的PBS(pH7.4)；0.2%G-PBS(4g·L-1葡萄糖+0.01mmol·L-1PBS).

主要仪器：PCR仪(2720ThermalCycle,AppliedBiosystems)、酶标仪(InfiniteF50,TECAN)、冷冻高速离心机(UNIVERSAL32R,Hettich)、恒温恒湿培养箱(XMT-9017，重庆永生实验仪器厂).

1.2实验方法

1.2.1菌种鉴定按照《伯杰氏细菌鉴定手册》的生理生化实验方法和16SrDNA方法对14株菌进行鉴定[22-23].

菌株荚膜多糖(cps)基因血清型分型[24-25]：采用TaKaRa细菌基因DNA试剂盒提取DNA，Ⅰa型引物序列为：Ⅰa-FGGTCAGACTGGATTAATGGTATGC，Ⅰa-RGTAGAAATAGCCT-ATATACGTTGAATGC；Ⅲ型鉴定引物序列为：Ⅲ-FTCCGTACTACAACAGACTCATCC，Ⅲ-RAGTAACCGTCCAT-ACATTCTATAAGC.50μL反应体系PremixTaq酶25μL，模板DNA2μL，引物各2μL，无DNase/RNase水19μL.反应条件：95 ℃预变性5min，94 ℃ 45s，58 ℃ 60s，72 ℃ 1min进行32个循环，最后72 ℃延伸10min.取5μL反应液在10g·L-1的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，其余样品送华大基因进行序列测序.

1.2.2罗非鱼红细胞悬液制备以吸取了适量肝素钠(1 400U·mL-1)的2.5mL无菌注射器从罗非鱼尾静脉采血，血样于4 ℃ 以3 000r·min-1离心5min，去上清，沉淀加入与血样等体积的0.2%G-PBS，洗涤3次(至上清无红色)，去上清，加入血样16倍体积的0.2%G-PBS，配制成罗非鱼红细胞悬液.

1.2.3菌悬液制备(1)待测菌种子液制备-20 ℃保存的菌种经BHI液体培养基活化后，按φ=1%的接种量接入新的BHI液体培养基，并于30 ℃静置培养12h，离心，收集菌体，用生理盐水制备OD620nm为0.68的待测菌种子液.

(2)菌悬液的制备将待测菌种子液按φ=5%的量接种于含6mLBHI液体培养基的15mL试管中，分成4组，分别于25 ℃，30 ℃和37 ℃静置培养，并于37 ℃以 180r·min-1振荡培养6h，每组3个平行，在4 ℃以 8 000r·min-1离心5min，用4 ℃预冷的0.01mmol·L-1的PBS洗涤2次，并以该PBS配制OD620nm为1.65的菌悬液.

1.2.4溶血价测定[10, 26]参照Gottschalk等[26]和Mereghetti等[10]的方法，以2倍梯度稀释法测定溶血效价，具体如下：取96孔板，吸取300μL菌悬液于第一孔中，然后用0.01mmol·L-1PBS溶液以2倍梯度稀释；再每孔加入150μL罗非鱼血红细胞悬液，于37 ℃孵育1h，转移至1.5mL离心管中，于4 ℃以 3 000r·min-1离心10min，取200μL上清液至新的96孔板中，用酶标仪测520nm处的吸光度值，每块96孔板分别设有阴性对照和阳性对照，阴性对照用150μL0.01mmol·L-1的PBS代替菌悬液，而阳性对照孔用0.1%的SDS溶液代替菌悬液，每个样品平行测定3次，按照式(a)计算溶血率(Hemolysisrate，HR)：

(a)

以菌浓度为横坐标，HR为纵坐标，采用OriginPro8.5.1SR2(OriginLabCorporation，美国)绘制散点图，并采用OriginPro8.5.1SR2的Analysis中的NonlinearCurveFit工具对散点图进行Logistic方程(式(b))拟合，获得拟合方程，然后根据拟合方程计算半溶血率菌液浓度(EC50)，按式(c)计算溶血价(HemolysisTiter，HT).

y=B2+(B1-B2)/(1+(x/x0)p)，

(b)

式(b)中y为HR，x为菌液浓度，B1，B2，x0和p为常数.

HT=1×109/EC50.

(c)

1.2.5统计分析采用OriginPro8.5.1SR2统计分析工具中的Tukey多重比较检验法，对同一菌株在不同培养温度下的溶血价差异进行分析，并对所有菌株在不同培养温度下的溶血价差异进行分析；此外，采用t检验方法对各菌株在静置培养与振荡培养下的溶血价差异进行分析.

2结果

2.1菌种的鉴定按照《伯杰氏细菌鉴定手册》对14株菌进行生理生化鉴定，结果显示：14株菌的各项生理生化指标与GBS一致(结果略).以16SrDNA法对14株菌测序并在NCBI上比对和构建系统进化树，结果显示：14株菌均与无乳链球菌A909聚为一支，相似性达99%以上(结果略).

以各菌株的DNA提取液为模板，采用荚膜多糖(cps)基因血清型Ⅰa引物序列进行PCR扩增、电泳，结果表明(图1)，只有菌株FWL1402和空白对照在521bp未出现特异性条带，表明只有FWL1402不是Ⅰa型，其余菌株均为Ⅰa型.采用荚膜多糖(cps)基因血清型Ⅲ引物序列进行PCR扩增、电泳，结果表明(图2)，只有FWL1402在1 826bp处出现特异性条带，表明只有FWL1402为Ⅲ型菌株.

1泳道为DNAmarkerDL2000，2—5泳道依次分别为PBSA0901，PBSA0902，PBSA0903，PBSA0904菌株；6泳道为空白对照；7—16泳道依次分别为PBSA0905，PBSA0906，PBSA1401，PBSA1501，PBSA1502，PBSA1503，PBSA1504，PBSA1505，Hn1404，FWL1402菌株

图1引物Ⅰa-F-Ⅰa-R鉴定Ⅰa型血清型

1泳道为DNAmarkerDL2000，2泳道为空白对照；3—16泳道依次分别为FWL1402，PBSA0901，PBSA0902，PBSA0903，PBSA0904，PBSA0905，PBSA0906，PBSA1401，PBSA1501，PBSA1502，PBSA1503，PBSA1504，PBSA1505，Hn1404菌株.

图2引物Ⅲ-F-Ⅲ-R鉴定Ⅲ型血清型

2.2溶血价的测定PBSA1501菌体浓度与溶血率的相关图及Logistic方程拟合的效果表明(图3，其余菌株的相关图和Logistic方程拟合的效果图略)，随着菌液浓度的升高，溶血率呈指数增加.采用Logistic方程拟合各菌株菌液浓度对溶血率的曲线，拟合相关系数(R2)均达到0.900 0以上，F检验显示Prob>F值，且均小于0.05，表明Logistic方程的拟合结果准确可靠.

根据拟合的Logistic方程及EC50计算溶血价，其结果表明(图 4)，菌株PBSA0901在37 ℃培养的溶血价最高，且其溶血价受培养温度的影响显著，在3个实验温度下，37 ℃培养时溶血价最高，30 ℃培养时溶血价最低.各菌株在不同温度下的溶血价差异性是通过Tukey多重比较检验法来分析的，其结果表明，14株实验菌株的溶血价均显著受培养温度影响，鳙鱼源HN1404和罗非鱼源PBSA0905在25 ℃培养时其溶血价最高，金鲳鱼源PBSA1401则是在30 ℃培养时其溶血价最高，除此之外，其余菌株的溶血价均在37 ℃培养时最高.

37 ℃培养时，静置培养和振荡培养对各菌株溶血价的影响的分析表明(图5)，在所有14株实验菌株中，只有PBSA1502和PBSA1504两株菌的溶血价不受振荡培养的影响，其余2株GBS菌株的溶血价均显著受振荡影响，其中有8株菌的溶血价在静置培养时比振荡时要显著升高，而另外4株菌的溶血价则在振荡培养时比在静置培养时要显著升高.

3讨论

由无乳链球菌引发的水生动物疾病大多发生在高温季节，其发生与温度的变化密切相关.Rodkhum[9]等的研究表明，高水温时GBS的侵染力更强.FreitasLione[11]等研究了37 ℃和40 ℃时人源GBS对人脐静脉内皮细胞的粘附和入侵能力的影响，其结果也表明，40 ℃时GBS粘附和入侵能力明显更高.Mereghetti[10]等在研究30 ℃和40 ℃培养条件下人源GBS的转录组时发现，40 ℃培养时GBS的毒力相关基因的表达量显著上调，说明温度是影响GBS毒力的主要因素之一.目前已证实，GBS的主要毒力因子包括β-溶血素、溶血促进因子(CAMP因子)、荚膜多糖、粘连蛋白结合蛋白、菌毛、补体C5α肽酶、纤维蛋白原结合蛋白、唾液酸酶、富色丝氨酸重复序列蛋白以及超氧化物歧化酶等.在GBS的致病过程中，溶血发挥着重要作用，而与溶血相关的毒力因子主要是β-溶血素和CAMP因子[27].刘志刚[14]等研究了温度对罗非鱼源无乳链球菌BSL2N#毒力的影响，其结果表明，该菌株β-溶血素和CAMP因子的基因表达量分别在34 ℃和37 ℃时达到最高；在37 ℃时，腹腔注射攻毒的致死率最高.本文研究了温度对14株来自不同地区、不同宿主和不同血清型的GBS溶血价的影响，研究结果与罗志刚等[14]的研究结果相似，所有实验菌株的溶血价均显著受培养温度影响，但不同菌株的溶血价受培养温度的影响不同，78.6%的菌株(11株)在37 ℃时溶血价最高，14.3%的菌株(2株)在25 ℃时溶血价最高，7.1%的菌株(1株)在30 ℃时溶血价最高.

不同GBS菌株的溶血能力差别较大，且受温度影响的表现也各不相同，它与宿主来源、分子血清型和采集区域均无明显相关性.卵形鲳鲹源菌株PBSA1401在30 ℃时溶血价最高，鳙源菌株HN1404与罗非鱼源菌株PBSA0905在25 ℃时溶血价最高，虎纹蛙源菌株FWL1404和10株罗非鱼源菌株的溶血价在37 ℃时最高.血清型Ⅰa型作为无乳链球菌的主要流行性血清型，不同来源的13株菌株中有10株的溶血价在37 ℃时最高.本实验中仅有的1株血清型Ⅲ菌株FWL1404(虎纹蛙源)，其溶血价在温度较低时显著增强.14株GBS菌株分离自海南省和广东省，但其溶血特性无明显的地区性差异.造成这种结果的原因可能与菌株致病力、适宜的生存环境以及对罗非鱼血的敏感性不同等有关.2015年从海南分离的5株罗非鱼源GBS菌株的溶血能力均在高温时较高，这与实际生产中温度越高罗非鱼链球菌病越易发病的现象相一致.

徐洋等[15]的研究结果表明，从海南分离获得的罗非鱼源无乳链球菌L4在THB肉汤培养基中于28 ℃静置培养时的溶血价要高于振荡培养时的溶血价.而本文有关振荡培养对实验菌株溶血价的影响的研究结果表明，振荡培养对不同菌株溶血价的影响也存在较大差异，85.7%的菌株(12株)的溶血价在振荡培养和静置培养时存在显著差异，在有显著差异的菌株中，66.7%的菌株(8株)的溶血价在静置培养时要显著高于振荡培养时，仅33.3%的菌株(4株)的溶血价在振荡培养时显著高于静置培养时.这表明不同类型GBS的溶血特性受培养方式的影响不同，其影响机制较为复杂，尚有待进一步的研究.

溶血作用是由穿孔毒素或理化因素造成的红细胞破裂现象，是许多病原微生物致病力的重要组成部分，病原菌通过溶血作用可促进其进入宿主细胞，并在机体内迅速传播.为此，本文研究了来自不同地区、不同宿主和不同血清型的GBS菌株的溶血能力受温度和培养方式影响的情况，旨在为了解环境对GBS致病力的影响.不过，GBS溶血作用的机理比较复杂，除β-溶血素和CAMP因子两种毒力因子外，还有可能存在其他多种未知的共同参与调控的毒力因子[13].今后，为了更深入地了解温度对GBS溶血作用的影响机制，需结合基因组和转录组等方法来进一步探讨.

4结论

GBS具有广泛的宿主，可对人、畜、鱼造成严重危害，尤其是在高温季节，它对罗非鱼养殖造成了巨大的影响.本研究考察了来自不同地区、不同宿主和不同血清型的14株GBS在不同培养温度和培养方式下的溶血价变化.研究结果表明，所有GBS菌株的溶血价均显著受培养温度的影响，但不同菌株的溶血效价受培养温度的影响存在一定差异，其中，大多数菌株在37 ℃培养条件下其溶血效价最高.本研究结果为了解环境对GBS致病力的影响以及防控GBS引起的水产疾病提供了参考依据.

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收稿日期：2016-02-25

基金项目：国家自然科学基金(31260644)；国家海洋公益性项目(201205025)；海南省自然科学基金(20153050)；农业部渔用药物创制重点实验室开放课题(201408)

作者简介：蒙爱云(1989-)，女，甘肃镇原人，海南大学海洋学院2013级硕士研究生，E-mail: 1243156384@qq.com 通信作者： 郭伟良(1983-)，男，广西贵港人，讲师，博士，研究方向：水产养殖病害研究，E-mail: guowl07@mails.jlu.edu.cn

文章编号：1004-1729(2016)02-0170-07

中图分类号：R 931.71

文献标志码：ADOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2016.0026

Effects of Culture Temperature on the Hemolysis Titerof14StrainsStreptococus agalactiaeIsolates

Meng Aiyun, Zhou Yongcan, Hu Wenting, Wu Mengxiao, Wang Shifeng, Xie Zhenyu, Guo Weiliang

(CollegeofMarinescience,KeyLaboratoryofTropicalAquaticBiotechnologyofHainanProvince,HainanUniversity,Haikou570228,China.)

Abstract：Temperature is one of the important environmental factors that influence the outbreak of streptococcosis in tilapia. In the study, to analyze the effects of culturing temperature on the hemolytic titer (HT) of Streptococcus agalactiae (GBS) isolates, fourteen S. agalactiae isolates from different regions, different hosts and different capsule polysaccharide serotype were selected, doubling dilution hemolytic test method was employed to determine the effects of three different temperatures (25 ℃, 30 ℃, and 37 ℃) culture conditions on the HT of the isolates, respectively, and the effects of static culture (37 ℃) and shaking culture (37 ℃) on the HT of the isolates were also determined. The results indicated that the HTs of 14 isolates were significantly affected by temperature; the HTs of 11 isolates had the highest values under 37 ℃ culture; the HTs of 2 isolates had the highest values under 25 ℃ culture; the HTs of 1 isolates had the highest values under 30 ℃ culture; All of five isolate in 2015 showed the same characteristics that HTs are increasing while the culturing temperature rise. The research results about the effects of culture conditions on the HT of the isolates suggested that twelve isolates were significantly affected by shaking culture conditions; the HTs of eight isolates under static culture(37 ℃) were higher than that under shaking culture of higher than shaking culture(37 ℃); the HTs of four isolates under shaking culture(37 ℃) were higher than that under static culture(37 ℃).

Keywords：Streptococus agalactiae; hemolytic titer; temperature