FTIR-ATR结合膜富集技术测定中药材地龙中微量铜的含量

蔡嘉华，尹嵩杰，陈超，王淑美，梁生旺



FTIR-ATR结合膜富集技术测定中药材地龙中微量铜的含量

蔡嘉华1，2，3，尹嵩杰1，2，3，陈超1，2，3，王淑美1，2，3，梁生旺1，2，3

（1.广东药科大学 中药学院，广东 广州510006；2.国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室，广东 广州 510006；3.广东高校中药质量工程技术研究中心，广东 广州510006）

摘要：目的利用傅里叶变换-衰减全反射红外光谱（FTIR-ATR）结合膜富集技术，建立中药材地龙中微量铜质量分数的快速、经济的测定方法。方法首先，对30批校正集样品进行湿法消解，利用铜与金属络合剂1-（2-吡啶偶氮）-2-萘酚（PAN）发生络合反应，优化各种反应条件，包括pH、PAN用量、反应时间。再将络合物抽滤富集在微孔滤膜上，采集其FTIR-ATR光谱，经9点平滑、一阶导数9点平滑等预处理后，利用随机森林回归算法建立其铜质量分数的定量校正模型。校正集按3∶1随机分配为训练集和测试集，对模型进行参数优化和评价。利用优化后模型预测广东、广西和福建3个产地地龙样品中铜的质量分数，并与ICP-MS测定结果进行比较。结果 最优模型预测3个产地地龙样品的质量分数在5.85～6.98 mg/kg之间，与ICP-MS分析结果相比，相对误差均小于20%。结论本方法利用膜富集技术提高了FTIR-ATR的检测灵敏度，为中药材重金属元素的定量分析提供了一种新方法。

关键词：膜富集；FTIR-ATR；随机森林；地龙；重金属

现今工业发展、环境污染等问题导致了中药材重金属污染问题日益严重，故中药材的安全性问题益发受到中药质量控制研究工作的重视［1-2］。在2015年版《中国药典》编制大纲中对提高中药安全性控制水平特别提出了一条：“要大幅增加和完善安全性检查项目，制定内源性有毒成分和外源性重金属及有害残留物的控制方法和限度”［3］。

地龙有清热定惊、通络、平喘、利尿的功效，是用于治疗高热神昏、惊痫抽搐、关节痹痛、高血压等的一味常用岭南道地药材。地龙本身对泥土中的重金属元素具有富集的特性［4-5］，或是因在加工炮制、储存运输等过程受到了重金属的污染等，频繁被查出重金属含量超标［1-2］。《中国药典》中记载地龙中重金属的检测方法为“通则0821第二法”［3］，即利用重金属离子与硫代乙酰胺的显色反应原理进行比色结果所得，标准为重金属的总质量分数不得超过30 mg/kg。本方法虽然快速简单，但是检测准确度受主观因素影响太大，且标准只限定了重金属的总质量分数，并没有具体到每一种元素；而每种重金属元素对人体产生危害的限量都是不一样的，即使总质量分数达到标准，个别也可能超出安全限量范围。传统的金属离子检测方法原子吸收光谱法（AAS）、原子发射光谱法（AES）、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）和电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）等，虽均有较高的灵敏度和准确度，但是其分析成本高、仪器昂贵，一般条件的实验室难以承担。

本文以傅里叶变换-衰减全反射红外光谱（FTIR-ATR）结合膜富集技术［6-8］，对中药地龙中铜元素质量分数进行测定，即通过湿法硝解将所含的铜元素全部转为游离态，然后与络合剂在一定条件下进行络合反应，最后将络合物富集于微孔滤膜之上，并采集光谱，应用随机森林算法建立Cu质量分数的定量校正模型。本法大大提高了红外光谱的分析灵敏度［9-11］，使红外光谱对重金属元素的微量分析成为可能，并具有快速、经济的特点，为中药材重金属定量分析提供了一种新方法。

1 仪器与试药

Tensor 37型傅里叶变换红外光谱仪（德国BRUKER公司，安装有OPUS7.2红外光谱软件），DLATGS检测器，水平3次全反射ATR附件，光谱范围400～4 000 cm-1，扫描间隔为2 cm-1，扫描次数为16次；PHS-3C数显酸度计（上海雷磁仪器厂）；JJ-1A电动搅拌器（江苏精密公司，100 W，0～3 000 r/min）；水系WX型微孔滤膜（上海新亚净化器件厂，0.22 μm）。

200 mg/L铜离子标准液、1-（2-吡啶偶氮）-2-萘酚（PAN）、1 mol/L HCl、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，按文献［12］方法配制；实验用水全部为超纯水，所用试剂均为分析纯。

地龙药材饮片采购自广州清平药材市场，经广东药科大学李书渊教授鉴定为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）去除内脏的干燥全体，产地分别为广东、广西和福建。

2 方法与结果

2.1 校正集样品的前处理和光谱采集

为提高定量模型的适用范围，本文采用合成样品，扩大校正集样本的浓度范围。取产地为广东的地龙药材1 g（所含Cu元素质量分数经中国广州分析测试中心应用ICP-MS准确测定），精密称定，粉碎后置于150 mL锥形瓶中，加HNO3和HClO4的混合酸（体积比4∶1）20 mL，进行湿法硝解。待硝解液冷却，过滤除去泥沙，用超纯水多次洗涤滤渣，将滤液合并后加入一定体积的铜离子标准液，即得合成样品溶液。重复上述操作，配制合成样品的质量浓度范围为5～500 mg/L，共30份。将样品溶液以NaOH中和至中性，然后以缓冲液调pH至9.5，置于电动搅拌器下，以800 r/min的速度一边搅拌一边缓慢加入PAN络合剂11 mL，搅拌反应7 min后，抽滤，将络合物富集于0.22 μm的微孔滤膜上，晾干，标记，采其光谱数据。同时做试剂空白。

2.2 络合反应条件的优化

本试验中络合反应的条件，包括pH值、络合剂用量、反应时间等，都对络合物的生成产生影响，因此必须进行优化。

如图1所示，Ⅰ为空白滤膜的红外吸收光谱，Ⅱ为试剂空白的红外吸收光谱，Ⅲ为Cu-PAN络合物的红外吸收光谱。通过对比3个光谱，发现在1 174、1 010、907、787 cm-14处波长点只有络合物有红外吸收而空白滤膜和试剂没有，因此可以认为是络合物的特征吸收。选定其中1个吸收较明显的波长点1 174 cm-1作为参考指标，通过单因素分析，分别考察了络合反应不同的pH、PAN用量和反应时间生成Cu-PAN的FTIR-ATR光谱图。

图1　空白滤膜（Ⅰ）、试剂空白（Ⅱ）和Cu-PAN络合物（Ⅲ）的红外吸收光谱图Figure 1 　IR absorption spectra of microporous filter membranes（Ⅰ），reagent blank（Ⅱ）and Cu-PAN complex compound（Ⅲ）

2.2.1 pH值的选择 金属络合剂与金属离子发生络合反应都有其相应的pH范围，根据文献［6-7］将考察的范围设置为7.5～10，结果如图2所示。从图2中可以看出，在所选取的Cu-PAN络合物特征吸收1 174 cm-1的波长点上，同一质量浓度的铜离子溶液在不同pH下反应络合反应所产生的络合物光谱吸光度大小具有明显的差异。从pH 7.5到9.5，反应所产生络合物浓度不断增大并在pH值为9.5时达到最大，在pH为10时络合物减少，说明铜离子和PAN的络合反应最适酸碱度在pH为9.5附近的弱碱环境，当碱性继续增强反而不利于络合物的形成，原因可能是铜离子的水解影响了络合物的生成。故选定9.5为铜离子与PAN络合反应的pH值。

2.2.2 PAN用量的选择 从试剂空白实验所采得光谱可以看出，试剂会产生明显的试剂峰，如果络合剂PAN用量过大，很可能会掩盖络合物在某些波段的吸收，在利用全谱建模时，就会影响模型的预测准确性；

图2　pH7.5～10环境下所生成Cu-PAN的FTIR-ATR光谱图（从上往下依次为pH 9.5、9.0、8.0、8.5、7.5、10）Figure 2 　FTIR-ATR spectra of Cu-PAN in pH7.5-10（pH 9.5，9.0，8.0，8.5，7.5，10 from the top to down）

因此，必须在保证PAN的用量能把铜离子完全络合的情况下，不因其过量而产生干扰。本文根据实验铜离子标准液和药材地龙中含铜元素的量，确定对PAN用量的考察范围为10～12.5 mL，结果如图3所示。从图3可看出，同一质量浓度的铜离子标准液和不同用量的络合剂反应所产生络合物的光谱吸收强弱是有差异的。加入络合剂用量为10到11 mL时，生成络合物的量缓慢增加，从11 mL开始，所产生络合物的量随着PAN用量增加而下降，因此选择最适PAN用量为11 mL。

图3　PAN用量为10～12.5 mL时所生成Cu-PAN的FTIRATR光谱图（从上往下依次为11、11.5、10.5、10、12、12.5 mL）Figure 3 　FTIR-ATR spectra of Cu-PAN with PAN of 10-12.5mL（11，11.5，10.5，10，12，12.5 mL from the top to down）

2.2.3 反应时间的确定 根据文献［12］所记载的方法，考察了反应时间为2～25 min的络合物生成效果，结果如图4所示。从络合物的FTIR-ATR光谱可以看出，随着同一质量浓度的铜离子标准液和PAN进行络合反应时间的不同，反应所产生络合物的光谱吸收强弱具有差异。从2 min到7 min的反应时间内，络合物不断地生成，并在7 min达到最多，从7 min开始缓缓下降，趋于平缓。由此可知在2 min时络合反应并没有进行完全，在7 min左右基本达到最大络合程度，之后可能随着剧烈的搅拌，少部分已经生成的络合物再次分解，因此络合物的量缓缓下降，最后趋于平缓，基本达到动态平衡。因此，选取铜离子和PAN络合反应的时间为7 min。

图4　反应时间为2～25 min时所生成Cu-PAN的FTIR-ATR光谱图（从上往下依次为7、12、15、20、25、2 min）Figure 4 FTIR-ATR spectra of Cu-PAN in reaction time of 2-25 min（7，12，15，20，25，2 min from the top to down）

2.3 随机森林校正模型

红外光谱源于多种化学基团的倍频和合频吸收，不容易用某一特征峰进行红外光谱定量分析，基团含量信息与其待测组分含量和性质指标之间也不能用简单的数学关系式来定量，因此化学计量学方法常被用于解决红外光谱定量分析中的多元校正难题［13］。本文以随机森林算法建立FTIR-ATR光谱的多元校正模型。

随机森林（random forest，RF）是由一系列决策树分类器h（x，θk），k=1，...，n组成的分类器集合，由Leo Breiman和Adele Cutler共同提出［14］。RF算法首先对样本的训练集进行有放回抽取k个相互独立的自助样本集，即bootsrap过程，而未被抽到的样本组成了k个用来预测分类结果正确率的袋外数据，然后对每个bootsrap样本构建ntree个决策模型构成RF，用RF对未知样本进行判别分类，最终结果按照分类器投票结果所得，回归的情况下，为决策树输出值的平均值［15］。

影响RF定量模型预测精度的主要有2个参数，分别是特征变量数（mtry）和决策树个数（ntree）［16-17］，本文采用网格搜索方法，对 mtry和ntree 2个参数分别在10～1 000和10～3 000范围内进行优化。本文以校正集的原始光谱（OS）、9点平滑光谱（9S）和一阶导数9点平滑光谱（1D9S）及其对应的浓度数据，分别归一化后，按3∶1随机分配成训练集和测试集，运行1 000次，以结果均值评价模型性能。

本文采用Abhishek Jaiantilal编写的 RF Mex/ Standalone工具包，在 MATLAB2010b软件中完成RF建模。

2.4 模型优化与评价

模型评价指标包括相关系数（R）、均方根误差（RMSE）和平均相对误差（MRE）。R越趋近于1，RMSE和MRE越趋近于0，模型的精度越高。其计算方法见本课题组已发表的论文［18-19］。

本文采用网格搜索方法对mtry和ntree 2个参数分别在10～1 000和10～3 000范围内进行优化，运行1 000次，以训练集和测试集的R、RMSE和MRE作为模型评价指标，结果如表1所示。筛选出OS光谱的最优模型的R、RMSEC和MRE分别为0.988 5、0.362 4和0.232 1，模型参数mtry为40，ntree为500，对测试集的预测结果 R、RMSEP和MRE分别为0.966 5、0.024 8和0.258 6；9S光谱的最优模型的R、RMSEC和MRE分别为0.986 7、0.332 2和0.135 2，模型参数mtry为840，ntree为500，测试集的R、RMSEP和MRE分别为0.945 1、0.033 8和 0.306 2；1D9S光谱的最优模型的 R、RMSEC和MRE分别为0.983 3、0.353 9和0.225 7，模型参数 mtry为800，ntree为500，测试集的 R、RMSEP和MRE分别为0.779 5、0.039 7和0.335 2。

从以上结果可知，1D9S光谱模型的预测效果并不理想，原因可能是导数光谱在消除基线和其他背景干扰的同时，把有用的光谱信息也一并去除了；相比之下，9S光谱和OS光谱所建模型的预测效果更佳，说明在本试验中，原始光谱包含的大量细节信息都比较重要。综合考虑，本文选择OS光谱建立的最优模型进行后续计算。

2.5 样品测定

分别取广东、广西和福建3个产地的地龙药材饮片1 g，精密称定，粉碎后经相同处理，包括湿法硝解、净化、络合、富集等过程，最后采集光谱。每个样品平行测定6次，取平均光谱代入校正模型计算，预测Cu元素的质量分数。同时将该3批药材送中国广州分析测试中心进行电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）检测，测定Cu元素的准确质量分数。结果列于表2。

从表2可以看出，3个产地地龙所含铜元素质量分数的预测相对误差均低于20%，说明本方法具有较好的准确性，可对实际样品进行测定。

表1 RF模型参数优化与评价结果Table 1 Optimization and evaluation results of RF model（¯x±RSD，n=1 000）

表2 最佳RF模型对3批地龙药材的预测结果Table 2 Prediction results of Pheretimae samples in optimal RF model

3 讨论

红外光谱多以透射谱形式出现，一般不直接用于微量或痕量分析；而衰减全反射（ATR）属于内反射光谱，它通过增加全反射的次数，增强了吸收谱带的强度，提高了分析灵敏度；同时，本文采用了膜富集技术，更加有效地提高了分析灵敏度，为中药微量重金属元素检测提供了新方法。在今后工作中，我们将对络合剂、配制络合剂用溶剂、微孔滤膜、缓冲溶液、其他离子干扰等因素进行深入讨论，以进一步完善本方法。

本文以膜富集技术结合随机森林回归模型对地龙饮片中的微量铜元素进行定量分析，最优模型对训练集和测试集的预测结果的R、RMSE和MRE分别为0.988 5、0.362 4、0.232 1和0.966 5、0.024 8、0.258 6，对3批不同产地的实际样品预测相对误差均小于20%，取得较好结果。本方法有望成为中药材重金属检测的一种快速、准确、经济的新方法。

参考文献：

［1］韩小丽，张小波，郭兰萍，等.中药材重金属污染现状的统计分析［J］.中国中药杂志，2008，33（18）：2041-2048.

［2］赵连华，杨银慧，胡一晨，等.我国中药材中重金属污染现状分析及对策研究［J］.中草药，2014，45（9）：1199-1206.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版四部［M］.北京：中国医药科技出版社，2015：101.

［4］李薇，沈克，杨洁瑜，等.广地龙对重金属富集特性的初步研究［J］.中药材，2007，30（5）：519-521.

［5］吴波.参环毛蚓对重金属镉离子的生理响应及其变化规律的研究［D］.广州：广州中医药大学，2010.

［6］朱碧琳，胡慧廉，JIBRAN IQBAL，等.膜富集-可见漫反射光谱法测定池塘水和维生素B12药片中痕量钴［J］.理化检验：化学分册，2015，51（2）：172-175.

［7］张晓芳，朱碧琳，李炜，等.表面活性剂-膜富集-紫外可见漫反射光谱法测定水中的痕量铅［J］.光谱学与光谱分析，2015，35（7）：1944-1948.

［8］邵学广，宁宇，刘凤霞，等.近红外光谱在无机微量成分分析中的应用［J］.化学学报，2012，70（20）：2109-2114.

［9］NING Yu，LI Jihui，CAI Wensheng，et al.Simultaneous determination of heavy metal ions in water using nearinfraredspectroscopywithpreconcentrationbynanohydroxyapatite［J］.SpectrochimActaAMolBiomol Spectrosc，2012，96（12）：289-294.

［10］LI Jihui，ZHANG Yan，CAI Wensheng，et al.Simultaneous determination of mercury，lead and cadmium ions in water using near-infrared spectroscopy with preconcentration by thiol-functionalizedmagnesiumphyllosilicateclay［J］. Talanta，2011，84（3）：679-683.

［11］SHENG Nan，CAI Wensheng，SHAO Xueguang.An approach by using near-infrared diffuse reflectance spectroscopy and resin adsorption for the determination of copper，cobalt and nickel ions in dilute solution［J］.Talanta，2009，79（2）：339-343.

［12］朱碧琳.膜富集-可见漫反射光谱法测定痕量重金属的方法研究［D］.上海：华东理工大学，2014.

［13］杜一平，潘铁英，张玉兰.化学计量学应用［M］.北京：化学工业出版社，2008：1-7.

［14］BREIMAN L.Random forests［J］.Mach Learn，2001，45 （1）：5-32.

［15］刘孝良.基于半监督学习的随机森林算法研究与应用［D］.青岛：中国海洋大学，2013.

［16］武晓岩，李康.基因表达数据判别分析的随机森林方法［J］.中国卫生统计，2006，23（6）：491-494.

［17］李欣海.随机森林模型在分类与回归分析中的应用［J］.应用昆虫学报，2013，50（4）：1190-1197.

［18］王伟伟，魏伟伟，宋向岗，等.不同预处理方法对苯丙酮尿症FTIR/ATR光谱筛查模型的影响［J］.光谱学与光谱分析，2015，35（5）：1218-1221.

［19］魏伟伟，王伟伟，宋向岗，等.应用多模型共识偏最小二乘法和FTIR/ATR光谱技术建立苯丙酮尿症的筛查模型［J］.分析科学学报，2015，31（2）：257-260.

（责任编辑：刘晓涵）

中图分类号：R284.1

文献标志码：A

文章编号：1006-8783（2016）03-0325-05

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016040803

收稿日期：2016-04-08

基金项目：国家自然科学基金 （81274059）；广东省自然科学基金（S2012010009166）；广州市珠江科技新星基金（2014J2200021）；广东省教育厅优秀青年教师基金资助项目（Yq2013102）

作者简介：蔡嘉华（1990—），女，2013级硕士研究生，Email：jiahuacai@163.com；通信作者：陈超（1981—），男，教授，硕士生导师，从事中药质量控制研究，Email：gdpuchenchao@163.com；梁生旺（1954—），男，教授，硕士生导师，从事中药质量控制研究，Email：swliang371@163.com。

Quantitative analysis on Cu content in pheretimae by FTIR-ATR spectra combining with membrane enrichment technology

CAI Jiahua1，2，3，YIN Songjie1，2，3，CHEN Chao1，2，3，WANG Shumei1，2，3，LIANG Shengwang1，2，3
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.State Administration of TCM，P.R.China，Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica，Guangzhou 510006，China；3.Engineering and Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of the Universites of Guangdong Province，Guangzhou 510006，China）

AbstractObjective To establish a rapid economic method for the determination of Cu content in the TCM pheretimae by FTIR-ATR spectra combined with membrane enrichment technology.Methods 30 calibration samples were processed by wet digestion and complexed by PAN a metal complexing agent for Cu.The complexing conditions including pH PAN quantity and reaction time were optimized with characteristic absorption of complex compounds as index.Then complex compounds were filtered in microporous membranes and the FTIR-ATR spectra of which were collected processed by 9-point smoothing and 9-point smoothing coupled with first differential etc.for the calibration.A calibration model of Cu content in pheretimae was established using random forest algorithm in which the calibration set was randomly assigned as training set and test set in 3∶1 ratio and the parameters were optimized as well.Cu contents

网络出版时间：2016-06-12 15：13 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160612.1513.003.htmlof pheretimae in Guangdong Guangxi and Fujian were predicted by optimized model and compared with ICP-MS results.Resluts The prediction concentrations in pheretima samples of three different roots using optimized model were between 5.85-6.98 mg/kg with relative error less than 20%compared with ICP-MS results.Conclusion A new method for the quantitative analysis of heavy metals in TCM was established and the sensitivity of FTIR-ATR was improved combined with membrane enrichment technology.The content of microscale Cu could be predicted in pheretimae properly.

Key wordsmembrane enrichment FTIR-ATR random forest pheretima heavy metals