玉米CMS–C型雄性不育系C543恢复基因的初定位

刘伟华，罗红兵，b*，邱博

（湖南农业大学 a.农学院；b.南方粮油作物协同创新中心，湖南 长沙 410128）

玉米CMS–C型雄性不育系C543恢复基因的初定位

刘伟华a，罗红兵a，b*，邱博a

（湖南农业大学 a.农学院；b.南方粮油作物协同创新中心，湖南 长沙 410128）

摘 要：以玉米恢复系614、B137分别与CMS-C型雄性不育系C543组配的F2代（614群体和B317群体）为试材，进行花粉育性鉴定和遗传分析。花粉育性镜检发现，C543花药内没有花粉，属于无花粉型雄性不育；遗传分析表明，C543的不育性状由1对隐性核基因控制，恢复系614和B137各有1对核恢复基因；SSR标记连锁分析结果将恢复基因定位在玉米8号染色体短臂上，位于标记umc1483附近，两者距离约16.9 cM。

关 键 词：玉米；雄性不育系；质核互作；连锁分析；基因定位

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雄性不育是玉米杂种优势利用的重要途径，尤其是细胞质雄性不育对实现玉米“三系”配套杂交种的生产具有重要意义。根据育性恢复专效理论，玉米细胞质雄性不育可分为C型、T型和S 型［1］。随着分子标记技术的发展，对玉米细胞质雄性不育的遗传基础和恢复基因定位进行了大量研究。Khey-pour等［2］认为玉米CMS-C型细胞质雄性不育是由1对显性恢复基因控制；陈伟程等［3］研究认为CMS-C型细胞质雄性不育由2对重叠基因控制，而陈绍江等［4］认为玉米 CMS-C型细胞质雄性不育的恢复基因由3对甚至更多的显性互补基因控制。Wise等［5］运用RFLP分子标记将Rf1定位在玉米3号染色体的标记umc97与umc92之间，将Rf2定位在9号染色体的标记umc153与sus1之间。王泽立等［6］运用分子标记将玉米 CMS-S型恢复基因 Rf3定位在2号染色体上，与标记RR6距离约为2.0 cM。李鹏等［7］利用BC1F1群体进行连锁分析，将Rf3精细定位在2号染色体长臂的标记A81和A134之间，两者相距Rf3分别为1.3和1.1 cM。恢复基因Rf4 和Rf5分别被定位在8号染色体的短臂上和5号染色体的长臂上，且两者具有叠加效应［8］。汤继华等［9］利用不育系Cms237和恢复系A6l9构建定位群体，

1 材料与方法

2013年春季，以CMS-C型雄性不育系C543为母本、自交系614为父本进行杂交，得到F1。夏季种植F1，套袋自交得到F2（614群体）。2013年夏季种植亲本C543和B137，于开花散粉期进行杂交，得到 F1；2014年春季种植 F1，并套袋自交得到F2（B137群体）。本研究所用材料为614群体和B137群体。

1.2 方法

1.2.1 花粉育性鉴定

在玉米F2群体开花散粉期，取群体单株未开放的小穗于冰盒中，带回实验室。采用花粉碘染法，于显微镜下观察花粉育性情况。

1.2.2 遗传分析

在F2群体开花散粉期，对其进行育性考察并统计，进行χ2检验，并取B137群体的不育单株的叶片提取DNA用于连锁分析。

1.3 叶片DNA的提取

目前中国旅游业已步入大众旅游阶段，但大众旅游者的旅游活动仍以观光旅游为主，休闲旅游与度假旅游尚处于快速增长之中。因而，遗产型旅游景区仍是旅游者出游的最佳旅游目的地。但受诸多因素影响，近年来国内各遗产型旅游景区门票涨声一片，其中依托高品质、世界级的自然、文化遗产旅游地涨幅更大。如世界自然遗产地九寨沟的门票由最初的108元调整至如今的220元，世界文化遗产地布达拉宫的门票也由最初的100元调整至300元等等。全面、快速的景区门票上涨，降低了景区的社会可进入性，致使低收入群体望景兴叹，其旅游需求难以满足。

采用改进的SDS法提取叶片DNA：取适当新鲜幼嫩玉米叶片于2 mL离心管中，加液氮，迅速用电钻磨碎，再加入750 μL Buffer A，颠倒混匀，65 ℃水浴45 min，其间轻摇几次，取出离心管，放置几分钟，依次加入氯仿和异戊醇各350 μL，上下颠倒，轻摇3 min，12 000 r/min离心10 min，上清液转入2 mL灭菌离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒摇匀，得DNA白色絮状沉淀，用玻璃棒挑出DNA于1.5 mL灭菌离心管中，用70%乙醇洗3次，无水乙醇冲洗1次，于超净工作台上风干，加适量TE溶解，并置于－20 ℃下保存，备用。

1.4 PCR反应体系及程序

PCR扩增采用10 μL反应体系，包括1 μL模板DNA，0.6 μL引物（F/R），3.4 μL Mix（内含dNTP、Taq酶、Buffer等，北京康为世纪公司提供），5 μL ddH2O。

扩增程序为94 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 变性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃ 延伸10 min。之后于4 ℃保存，备用。PCR扩增产物用 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行银染，显影观察统计并拍照。

1.5 多态性标记的筛选

首先利用271对Indel标记（由中国农业大学金危危老师提供），筛选出52对在亲本间具有多态性的标记。但该类型的多态性标记分布不均，未完全覆盖所有染色体两条臂，因此，利用已有的SSR标记进行适当补充，共筛选出 43对在亲本间具有多态性的SSR标记。

1.6 电泳条带统计与重组率计算

根据显影观察结果，将不育突变体基因型标记为1，恢复系基因型标记为2，杂合基因型标记为3。

重组率=重组数/（个体总数×2）。将1%的重组率换算成1 cM，计算标记与目的基因的遗传距离。

2 结果与分析

2.1 雄性不育系C543的花粉育性鉴定结果

在F2群体开花散粉期，对C543不育株和可育株雄穗中部未开放小穗的花药进行碘-碘化钾染色，镜检结果见图1。从图1可知，可育株的花粉碘染后呈现出蓝黑色（图1-A），且花粉粒形状规则，这表明该类型植株的花粉育性正常，能够正常受精结实，而不育株的花药内没有观察到花粉粒，无法进行碘-碘化钾染色（图 1-B），这说明不育株的花药在发育过程中出现了异常，无法形成正常可育的花粉粒，最终导致败育。

图1 C543可育株和不育株的花粉碘染镜检结果Fig. 1 Result of I2–KI solution-stained pollen for fertile and sterile individuals

2.2 雄性不育系C543的遗传分析

对614群体和B137群体进行田间育性观察和统计分析结果（表1）表明，2个群体中不育单株数与可育单株数的比例分别为3.489∶1和3.222∶1，经χ2检验，符合3∶1的理论分离比，说明C543的不育性状是由1对隐性核基因控制的，在恢复系中有对应的显性育性恢复基因。

表1 F2群体中可育株与不育株的分离比例Table 1 The segregation ratio of plants for wild type and mutant type in F2populations

2.3 雄性不育系C543育性恢复基因的连锁分析

利用筛选出的43对SSR标记对C543的34个不育单株进行基因分型，发现8号染色体短臂上的标记umc1483扩增产物条带出现偏分离现象，且有少数交换带型，而其他SSR多态性标记的扩增结果也是不育带型、可育带型和杂合带型随机分离，因此，可以初步确定标记umc1483与目的基因连锁（图2）。利用umc1483对B137群体中的65个不育单株进行基因分型，经统计，有 42条带为不育亲本带型，有18条带为杂合带型，只有4条带为可育亲本带型，这说明F1在形成配子时，同源染色体非姐妹染色单体片段间发生交换，且单交换多于双交换。65个单株中得到 22株重组单株，重组率为16.9%，目的基因与umc1483的相对遗传距离约为16.9 cM。

图2 标记umc1483在亲本间与部分F2群体不育单株中的扩增结果Fig. 2 Result of DNA amplified by marker umc1483 between parents and some F2individuals

3 结论与讨论

本研究结果表明，雄性不育系C543花药内无花粉存在，败育彻底；614群体和B137群体中不育株和可育株的分离比及卡方检验的结果证实 C543的不育性是由1对隐性基因控制的，相应的恢复系中有显性恢复基因存在，使育性得以恢复。

亲本间多态性标记的多少，标记的分布均匀度及标记质量的高低都会对后期的连锁分析产生一定影响。本试验利用 Indel标记在亲本间进行多态性筛选时，一共筛选到 52对多态性标记，但标记分布不均匀且部分标记多态性不好，在连锁分析中也并未发现有偏分离的标记，可能是由于标记距离目的区域较远。利用SSR多态性标记进行连锁分析时，发现8号染色体短臂上的标记umc1483在群体不育株扩增时出现偏分离现象，初步判断其与目的基因存在连锁。汤继华等［9］也将一个玉米C型胞质不育的恢复基因Rf4初步定位在8号染色体的短臂上，但不知道其连锁标记 bnlg2307位置是否与umc1483接近，两者是否为同一位点。而段柳静［10］在8号染色体8.00-8.01 Bin区对恢复基因Rf4进行定位的位置与本研究中定位的连锁标记 umc1483比较接近。通过对恢复基因进行SSR标记的定位分析，经重组率换算可知目的基因与umc1483的遗传距离较大，约为16.9 cM，这可能是由于群体数量少的原因造成的，也可能是由于连锁标记距离目的基因的实际物理距离还较远。本研究只找到与目的基因连锁的单侧标记，且遗传距离较大，未来的工作要加大群体数量，继续对umc1483附近进行标记开发或使用新型标记。

本试验的分子生物学实验部分在中国农业大学金危危老师帮助下完成，对金危危老师的指导与帮助表示真心感谢！

参考文献：

［1］ 李小琴，刘纪麟，万邦惠，等．玉米 CMS育性恢复专效性分类系统的研究［J］．华中农业大学学报，1999（3）：1-4．

［2］ Kheyr-Pour A，Gracen V E，Everett H L．Genetics of fertility restoration in the C-group of cytoplasmic male sterility in maize［J］．Genetics，1981，98：379-388．

［3］ 陈伟程，罗福和，季良越．玉米C型胞质雄性不育的遗传及其在生产上的应用［J］．作物学报，1979，5（4）：21-28．

［4］ 陈绍江，陈伟程．玉米C型胞质雄性不育恢复基因的定位研究［J］．河南农业大学学报，1989，23（3）：201-208．

［5］ Wise R P，Schnable P S．Mapping complementary genes in maize：positioning the rf1 and rf2 nuclearfertility restorer loci of Texas （T） cytoplasm relative to RFLP and visible markers ［J］．Theor Appl Genet，1994，88（6/7）：785-795．

［6］ 王泽立，王鲁昕，戴景瑞，等．运用近等基因系（NIL）、AFLP、RFLP和SCAR标记对玉米S组育性恢复基因（Rf3）的研究［J］．遗传学报，2001，28（5）：465-470．

［7］ 李鹏，肖森林，王淑霞，等．玉米S型细胞质雄性不育恢复基因Rf3的精细定位及其候选基因预测［J］．山东农业科学，2014，46（8）：1-5．

［8］ 丁安明，李凤霞，陈夏晔，等．植物细胞质雄性不育恢复基因的定位和克隆研究进展［J］．分子植物育种，2014，12（3）：618-628．

［9］ 汤继华，胡彦民，季洪强，等．玉米C型Cms育性恢复基因 Rf4的 SSR标记［J］．河南农业大学学报，200l，35（l）：1-3．

［10］ 段柳静．玉米C型胞质雄性不育育性恢复主基因Rf4的精细定位［D］．郑州：河南农业大学，2009．

责任编辑：尹小红

英文编辑：梁 和

中图分类号：S513；Q78

文献标志码：A

文章编号：1007-1032（2016）01-0016-04

收稿日期：2015-09-08 修回日期：2015-12-18

基金项目：“十二·五”农村领域国家科技计划项目（2011BAD35B01）；湖南省科技计划项目（2013TP4096）；长沙市科技计划项目（K1406002-61）

作者简介：刘伟华（1990—），男，福建南平人，硕士研究生，lwillhall@163.com；*通信作者，罗红兵，教授，主要从事玉米种质创新的新技术及应用研究，hbluo48@sohu.com将Rf4定位在8号染色体短臂上，位于标记bnlg2307附近。利用分子标记定位育性恢复基因，对深入研究细胞质雄性不育的育性恢复机理具有重要意义。笔者对不育系C543的不育特征和遗传特征进行分析，并利用分子标记对育性恢复基因进行初步定位研究，以期为将来的基因克隆、功能机理研究和雄性不育的利用提供参考依据。

Primary mapping of restoring gene for CMS-C cytoplasmic male sterility line C543 in maize

Liu Weihuaa，Luo Hongbinga，b*，Qiu Boa
（a. College of Agronomy； b. Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China）

Abstract：Two F2generations， which from the hybridizations of C543×614 and C543×B137， were used as experiment materials to analyze the pollen fertility and inheritance. The results showed that C543 was pollen-free male sterility，which was controlled by a pair of recessive nuclear genes， and there was a restoring gene in restorer 614 and B137，respectively. With the analyzing of SSR， the restoring gene of B137 was mapped on short arm of chromosome 8 and 16.9 cM from the marker umc1483.

Keywords：maize； male sterility line； cytoplasm-nuclear interaction； linkage analysis； gene mapping