响应曲面法优化野蔷薇根多糖的提取工艺及抑菌作用研究

阿吾提·艾买尔，古力齐曼·阿布力孜，其买古丽·阿沙木，迪丽努尔·马里克

（新疆师范大学化学化工学院，新疆乌鲁木齐830054）

响应曲面法优化野蔷薇根多糖的提取工艺及抑菌作用研究

阿吾提·艾买尔，古力齐曼·阿布力孜，其买古丽·阿沙木，迪丽努尔·马里克*

（新疆师范大学化学化工学院，新疆乌鲁木齐830054）

利用响应曲面法优化野蔷薇根多糖的提取工艺，并对提取液进行抑菌活性研究。以野蔷薇根多糖得率为指标，采用单因素和响应曲面法对提取温度、提取时间、料液比和微波功率进行考察，优化最佳提取条件。采用平板打孔法和试管稀释法对野蔷薇根多糖进行抑菌实验。结果表明，野蔷薇根多糖的最佳提取工艺为提取时间22min，微波功率317W，提取温度81℃，料液比32：1mL/g，实测的多糖得率为6.10mg/g，与模型理论值基本符合。野蔷薇根多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、奇异变形杆菌都具有较明显的抑制作用。模型可较好地预测野蔷薇根多糖的得率，响应面法对野蔷薇根多糖提取条件参数优化具有可行性。

野蔷薇根；多糖；响应曲面法；超声-微波辅助提取；抑菌作用

新疆维吾尔民间中常用药材新疆野蔷薇具有一定的健脾理气、养血调经、助消化等作用，广泛用于治疗胃功能失调、慢性气管炎、肠炎等多种疾病［1-3］。多糖是野蔷薇中最重要的活性成分之一，具有较高的药用价值。研究表明，多糖具有增强机体免疫功能、抗病毒、降血脂、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化等作用［4，5］，甚至对艾滋病病毒有一定的防御功能［6］。因此对多糖的研究越来越引起人们的关注。关于野蔷薇根多糖的提取工艺方面未见文献报道。文章以野蔷薇根多糖为研究对象，以野蔷薇根多糖得率为指标，对超声-微波辅助提取法进行响应曲面分析优化得到最佳提取工艺条件，并对野蔷薇根多糖进行抑菌活性研究，为我区野蔷薇资源的开发利用提供理论依据和开发指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料及试剂

野蔷薇根（采自新疆喀什巴楚县）、葡聚糖标准品、乙醇（95%）、正丁醇、苯酚、石油醚、三氯甲烷、浓硫酸、氯化钠、蛋白胨、母粉、大肠杆菌（Escherichiacoli）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、奇异变形杆菌（Proteusmirabilis）均由新疆师范大学生物系细胞生物学实验室提供（以上药品均为分析纯）。

1.1.2 仪器设备

微波超声波组合合成/萃取仪（型号：XH-300B；生产地：北京样祥鹄科技发展有限公司）；紫外可见分光光度计（型号：UV-2100；生产地：北京瑞利分析仪器有限公司）；循环水式真空泵（型号：SHZ-D（Ⅲ）；生产地：巩义市英峪予华仪器厂）；旋转蒸发器（型号：RE-52AA；生产地：上海亚荣生化仪器厂）；电子天平（型号：AL204；生产地：梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司）；高速多功能粉碎机（型号：HFP-200；生产地：永康市红太阳机电有限公司）；恒温水浴振荡摇床（型号：ZHWY-110X；生产地：上海智城分析仪器制造有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理

取一定量野蔷薇根，粉碎，过16目筛，用石油醚脱脂，干燥，用密封袋包装并置于干燥器内备用。

1.2.2 野蔷薇根多糖提取工艺流程

处理过的野蔷薇根粉末1.000g→超声微波提取→抽滤→减压浓缩→醇沉（4倍体积）→离心分离→溶解沉淀→Sevage法脱蛋白→过滤→取其滤液→定容。

1.2.3 多糖含量的测定

以苯酚-硫酸法检测多糖含量：准确称取干燥至恒重的葡聚糖0.010g，溶于100mL容量瓶中，定容，摇匀，配成浓度为0.1mg/mL葡聚糖标准溶液。分别吸取此溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL于10mL具塞比色管中，用去离子水补至2mL，再加入1mL苯酚（5%）和5mL浓硫酸，摇匀，室温放置20min，置沸水浴加热15min，取出冷却30min，以去离子水作为空白于488nm处测其吸光度值，以吸光值Y和葡聚糖浓度X（ug/mL）计算回归方程，得标准曲线方程为Y=0.0667X+0.005786，相关系数R=0.9994。精密吸取多糖溶液2mL，按照上述的方法测定野蔷薇根多糖含量。

式中：C为提取液多糖质量浓度（mg/mL）；V为提取液总体积（mL）；W为野蔷薇根粉末质量（g）。

1.2.4 响应面优化实验设计［10-12］

在单因素的基础上，利用Design-Expert8.0.5中的Box-Behnken原理设计试验方案，分别考察各自变量（提取温度、微波功率、料液比及提取时间）对影响值（野蔷薇根多糖得率）的影响并对试验条件进行优化。实验因素与水平设计见表1。

表1 响应面实验因素水平表

1.2.5 抑菌实验［13，14，15］

1.2.5.1 培养基的配置

LB（Luria-Bertani）液体培养基：准确称取蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母粉5g，加入蒸馏水1000mL，加热溶解，用1mol/LNaOH调pH值为7.0，于121℃灭菌20min。

LB固体培养基：LB液体培养基中加1.6%琼脂粉，煮沸熔化后定容，在温度为121℃条件下灭菌20min。

1.2.5.2 菌液的制备

将供试菌活化两代后，分别接入培养基上，培养18-24h，温度保持37℃。分别取已活化的供试菌种接种于LB液体培养基中，温度为37℃、160r/min震荡培养16-18h，采用10倍稀释法，用生理盐水稀释至10000倍备用。

1.2.5.3 抑菌测定方法

抑菌效果经打孔法测定：取直径6mm打孔器均匀打孔圆形滤纸片，灭菌备用。取7支试管，按试管稀释法进行稀释，第一管中分别加入培养液和药，各加入体积为1mL，第一管混匀后吸取1mL加入第二管中，依次倍比稀释好至第5管，混匀后第5管弃去1mL，将滤纸片浸泡在各浓度的溶液中。用无菌移液枪吸取0.2mL菌液涂布在已灭菌的培养皿上，然后取出在不同浓度总鞣质纯化液里浸泡过的滤纸片，每皿贴4片。每个菌再用未浸泡过的滤纸片做1份空白对照，空白对照组加入等量的去离子水。然后将各菌放在最适生长温度的培养箱中培养18-20小时，取出后测定抑菌圈直径，比较抑菌效果。

2 结果与讨论

2.1 野蔷薇根多糖提取单因素实验

2.1.1 提取温度对野蔷薇根多糖得率的影响

1.000g已烘干粉碎处理过的野蔷薇根粉末加入按30∶1（mL/g）的料液比向样品中加入去离子水，固定的超声功率为50W、微波功率为250W、提取时间为15min，考察不同提取温度对野蔷薇根多糖得率的影响，结果见图1所示。

图1 提取温度对野蔷薇根多糖得率的影响

由图1可知，当提取温度80℃时，野蔷薇根多糖最高，提取温度小于80℃时多糖得率较低，因为其温度较低，多糖未能充分溶出，所以随着提取温度的升高多糖得率也增加。当提取温度超过80℃时，多糖得率反而下降，这可能是因为温度过高导致多糖类化合物分解。故温度选80℃效果最好。

2.1.2 微波功率对野蔷薇根多糖得率的影响

1.000g已烘干粉碎处理过的野蔷薇根粉末加入按30：1（mL/g）的料液比向样品中加入去离子水，固定的超声功率为50W、微波功率为250W、提取时间为15min、提取温度为60℃，考察不同微波功率对野蔷薇根多糖得率的影响，结果见图2所示。

图2 微波功率对野蔷薇根多糖得率的影响

由图2可知，野蔷薇根多糖得率随微波功率的增加而增加，但微波功率过大得率反而下降。这可能是因为前期微波功率的增加提供了足够的热量，加速了野蔷薇根细胞破壁的速率，使多糖大量释放并溶于溶剂水中；但后期微波功率超过300W以后，得率处于下降趋势，这可能与多糖在较高温度下不稳定而分解有关。因此，确定微波功率为300W较适合。

2.1.3 料液比对野蔷薇根多糖得率的影响

1.000g已烘干粉碎处理过的野蔷薇根粉末加入按不同的料液比向样品中加入去离子水，固定的超声功率为50W、微波功率为250W、提取时间为15min、提取温度为60℃，考察不同料液比对野蔷薇根多糖得率的影响，结果见图3所示。

由图3可知，多糖得率随料液比的增大而增加，但当料液比超过30：1（mL/g）时多糖得率随着液料比的增加得率反而下降。这可能是因为前期液料比用量越多，传质推动力越高，多糖的得率就越完全；但过高液料比对多糖得率增加效率有限，反而会增加浓缩时间及提取费用。因此，较优的料液比为30：1（mL/g）。

图3 料液比对野蔷薇根多糖得率的影响

2.1.4 提取时间对野蔷薇根多糖得率的影响

1.000g已烘干粉碎处理过的野蔷薇根粉末加入按30∶1（mL/g）的料液比向样品中加入去离子水，固定的超声功率为50W、微波功率为250W、提取温度为60℃，考察不同提取时间对野蔷薇根多糖得率的影响，结果见图4所示。

图4 提取时间对野蔷薇根多糖得率的影响

由图4可知，随着提取时间的延长，多糖得率逐渐增加，在提取时间延长到20min时，得率增加趋于平缓，说明多糖基本被提取，考虑能耗和成本。故提取时间以20min为宜。

2.2 响应曲面法优化野蔷薇根多糖提取工艺

2.2.1 响应曲面实验设计与结果

在单因素试验的基础上设计响应面试验。具体的实验设计及数据处理如表2所示。

表2 响应面实验设计及数据处理

表2为不同实验条件下所测定的野蔷薇根多糖得率，利用软件Design-Expert8.05对实验数据进行处理，得到野蔷薇根多糖得率和提取温度、微波功率、料液比和提取时间之间的二次多项回归模型为：

Y=5.88+0.16A+0.40B+0.25C+0.17D+0.29AB+0.060AC-0.025AD+0.025BC+0.32BD+0.17CD-0.87A2-0.38B2-0.46C2-0.47D2

对回归模型及其系数进行显著性分析。结果见表3。

表3 回归方程系数显著性分析

由表3可知，模型的P值<0.001，表明回归模型极显著；并且该模型的R2=0.9764，R2Adj=0.9528，说明该模型与实际实验拟合较好，自变量与响应值之间线形关系显著，实验误差小，可以用于野蔷薇根多糖实验的理论预测。

回归模型系数的显著性分析结果表明模型的一次项、二次项的影响都是极度显著的，交互项中CD的影响是显著的，AB和BD的影响是极显著的，而其余的交互项则不显著，因此各个具体实验因子对响应值的影响不是简单的线形关系。

2.2.2 响应曲面与等高线分析

根据回归模型绘出的响应面图形是三维空间的曲面图及二维平面上的等高线图，其可以直观地反映各因素对响应值的影响，从所得响应面图上可以分析出它们之间的交互作用，如等高线为椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。详见图5-10。

图5 提取温度和微波功率对多糖得率影响的响应曲面图和等高线图

图6 提取温度和料液比对多糖得率影响的响应曲面图和等高线图

图7 提取温度和提取时间对多糖得率影响的响应曲面图和等高线图

图8 微波功率和料液比对多糖得率影响的响应曲面图和等高线图

图9 微波功率和提取时间对多糖得率影响的响应曲面图和等高线图

图10 料液比和提取时间对多糖得率影响的响应曲面图和等高线图

由图5-10可知，提取温度和微波功率以及微波功率和提取时间的相互作用是极显著的，料液比和提取时间的相互作用是显著的，而其余的相互作用不显著，与交互项P值的分析结果一致。

2.3 超声-微波辅助提取野蔷薇根多糖最佳工艺参数的确定及模型验证

2.3.1 最佳优化条件

通过Design-Expert8.05得出最佳提取工艺条件为A=81℃，B=317W，C=32：1（mL/g），D=22min，在此工艺条件下，野蔷薇根多糖得率的理论值达到6.16mg/g。

2.3.2 回归模型的验证实验

为了检验所得试验结果的可靠性，采用上述优化的条件下，对野蔷薇根多糖进行3次平行提取，实际测得的平均多糖得率为6.10mg/g，与试验预测值相比，其相对误差约为0.98%，因此，采用响应曲面法优化得到的提取工艺参数均为准确可靠。

2.4 野蔷薇根多糖抑菌实验结果

将蔷薇根多糖提取液配制成浓度为100%（15mg/mL）、50%、25%、12.5%、6.25%等5个系列的浓度进行测定，结果见表4。

表4 浓度对多糖提取液抑菌活性的影响（抑菌圈直径：mm）

由表4可知，野蔷薇根多糖对供试菌种的最低抑菌浓度分别为：枯草芽孢杆菌3.75mg/mL，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和奇异变形杆菌1.875mg/mL。

3 结论

本研究通过单因素试验初步确定提取温度、微波功率、料液比及提取时间对多糖得率影响的有效范围，根据单因素试验结果采用响应曲面法优化野蔷薇根多糖的超声微波提取工艺，并在奇异变形杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌之上进行抑菌试验。优化后的最佳提取工艺条件为：提取温度81℃，微波功率317W，料液比32：1（mL/g）提取时间22min，在此条件下野蔷薇根多糖得率实测值为6.10mg/g，与理论值的相对误差不大。表明响应曲面法能较好地预测野蔷薇根多糖的得率。抑菌实验结果表明，野蔷薇根多糖具有一定的抑菌作用。它所具有的抑菌功能使其有望作为天然抑菌剂和功能性产品而得到开发利用价值。

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Response Surface Methodology for Optimization of Extraction Conditions of Polysaccharide from Rosa Multiflora Thunb and Antibacterial Activity

Awuti·AIMAIER，Gulqiman·ABLIZ，Qimanguli·ASHAMU，DILINUER·MALIKE
（SchoolofChemistry and ChemicalEngineering，Xinjiang NormalUniversity，Urumqi,Xinjiang,830054,China）

To optimize the extraction technology of RosaMultiflora Thunb polysaccharidesby response surface method（RSM）and test its antibacterial activity.Extraction temperature，microwave power，extraction time and ratio ofmaterial to liquid were investigated by single factor testand RSM using the yield of Rosa Multiflora Thunb polysaccharidesas index to optimize the extraction technology.The antibacterialactivitywasevaluated by themethodsof disk diffusion and standard tube dilution.The optimal condition obtained from RSM wasas follow：extraction temperature 81℃，microwave power 317W,extraction time 22 min，the ratio of liquid tomaterial 32：1（mL/g）.The yield of polysaccharideswas 6.10mg/g，which was in linewith theoretical value basically.The polysaccharide from the Rosa Multiflora Thunb had strong inhibiting effects on some pathogenic bacterium such as Bacillus subtilis, Escherichia coli、Staphylococcus aureus and Proteusmirabilis.Themodelwell predict the yield of Rosa Multiflora Thunb polysaccharides，and RSM is feasible to optimize the extraction technology of RosaMultiflora Thunb polysaccharides.

Rosa Multiflora Thunb；Polysaccharide；Response surface；Ultrasonic-microwave assisted extraction；Antibacterialactivity

Q946.8

A

1008-9659（2016）02-0010-08

2016-03-25

国家自然科学基金项目（21165018）。

阿吾提·艾买尔（1988-），男，新疆乌鲁木齐人，硕士研究生，主要从事天然产物研究。

*［通讯作者］ 迪丽努尔·马里克（1964-），女，新疆乌鲁木齐人，教授，主要从事天然产物研究。