急性期川崎病γ干扰素组蛋白乙酰化改变及意义初探

梅洁花 崔 冬 王 勤 温鹏强 徐明国 唐 根 刘 琮 李成荣 王国兵

·论著·

急性期川崎病γ干扰素组蛋白乙酰化改变及意义初探

梅洁花1,3崔 冬1,3王 勤2温鹏强1徐明国1唐 根1刘 琮1李成荣1王国兵1

目的 探讨急性期川崎病(KD)患儿IFN-γ组蛋白乙酰化改变及其在KD免疫发病机制中的作用。方法 以2015年2月至2016年6月深圳市儿童医院诊断并住院治疗的KD患儿为KD组，经IVIG治疗后为KD-IVIG组，KD组依冠状动脉有无损伤分为冠状动脉损伤(KD-CAL+)亚组和无冠状动脉损伤(KD-CAL-)亚组，于IVIG治疗前、后取血备检；同期体检的健康儿童为对照组。采用染色质免疫共沉淀法检测外周血CD4+T细胞IFN-γ组蛋白H3乙酰化水平及组蛋白乙酰化酶p300和去乙酰化酶HDAC1/2结合水平；流式细胞术检测外周血CD4+IFN-γ+细胞(Th1)比例及IFN-γ、pSTAT4、pSTAT5和T-bet蛋白表达水平；实时荧光定量PCR检测CD4+T细胞IFN-γ、IL-2Rα/β、IL-12Rβ1/2、IL-18Rα/β和ITLR4 mRNA表达；ELISA检测外周血浆中IL-12、IL-2和IL-18浓度。结果 ①KD患儿38例(男20例)，年龄1～5.2岁；KD-CAL+亚组16例，KD-CAL-亚组22例。对照组32例(男17例)，年龄1.2～4.9岁。KD组和对照组年龄、性别差异无统计学意义。②急性期KD患儿Th1细胞比例、IFN-γmRNA和蛋白表达及其组蛋白乙酰化水平显著高于对照组(P<0.05)，且KD-CAL+亚组高于KD-CAL-亚组(P<0.05)，经IVIG治疗后明显恢复(P<0.05)。③急性期KD患儿CD4+T细胞IFN-γ组蛋白乙酰化酶p300结合水平显著增加(P<0.05)，HDAC1/2结合水平明显降低(P<0.05)，p300/HDAC1/2明显高于对照组且与IFN-γ组蛋白H3乙酰化水平呈正相关 (r=0.52;P<0.05)，经IVIG治疗后均有所恢复(P<0.05)。其中KD-CAL+亚组p300结合水平及p300/HDAC1/2比值均高于KD-CAL-亚组 (P<0.05)，而HDAC1/2结合水平则低于后者(P<0.05)。④急性期KD患儿血浆IL-2、IL-12和IL-18浓度显著增高(P<0.05)，CD4+T细胞表面受体IL-2Rα/β、IL-12Rβ1/2、IL-18Rα/β和TLR4及其下游信号分子pSTAT5、pSTAT4、T-bet和MyD88表达明显上调(P<0.05)，且KD-CAL+亚组前述各项均高于KD-CAL-亚组(P<0.05)，经IVIG治疗后均有不同程度恢复(P<0.05)。结论 IFN-γ组蛋白过度乙酰化可能是导致急性期KD患儿免疫功能紊乱的重要因素之一。

川崎病； IFN-γ； 组蛋白乙酰化； Th1细胞； 免疫

川崎病(KD)是一种急性免疫功能紊乱所致的全身血管炎综合征，其病因及发病机制迄今仍未完全阐明[1-3]。Ⅰ型辅助性T细胞(Th1)是一类介导机体细胞免疫功能的T细胞亚群，其数量或功能异常可导致自身免疫性疾病的发生[4-6]。IFN-γ是Th1细胞分泌的标志性细胞因子，在其分化、成熟及免疫功能中发挥着重要作用。研究已证实外界刺激或细胞微环境改变可导致Th1细胞IFN-γ蛋白表达及功能异常[7-9]，但调节IFN-γ表达的分子机制尚不完全清楚。组蛋白乙酰化是一种常见的表观遗传学修饰，通过改变染色质的空间结构而调节相关基因的转录活性[10,11]。本文通过观察KD患儿IFN-γ基因组蛋白乙酰化修饰及相关信号的改变，探讨导致急性期KD患儿Th1细胞异常活化的可能分子机制，从而进一步阐明KD及其血管损伤的免疫发病机制。

1 方法

1.1 研究设计 以病例对照研究设计。收集入住遵义医学院深圳市儿童医院(我院)的KD患儿，以急性期KD患儿为KD组、同期我院体检的健康儿童为对照组，观察KD组及其IVIG治疗后IFN-γ组蛋白乙酰化和相关信号分子的表达变化。

1.2 伦理和知情同意 本研究经我院伦理委员会审核同意。KD组患儿分别于急性期及IVIG治疗有效后4～5 d取血备检，对照组于体检当日取血备检 ；两组受试儿童及其父母或监护人了解本研究的目的，自愿参与本研究。

1.3 KD的诊断标准[12]日本川崎病研究会制定的标准：①体温39～40℃﹥5 d；②急性期手脚末梢出现红肿，第2～4周时可能在手脚掌或指尖及肛门周围产生脱皮现象；③多形性红斑；④两侧性结膜炎，结膜充血、发红，通常无分泌物；⑤口腔黏膜变化，如草莓舌、口腔咽喉黏膜充血，嘴唇红肿、干裂甚至流血；⑥急性非化脓性颈部淋巴结肿大，单侧或双侧，直径﹥1.5 cm。除符合第①项之外，还需要满足②～⑥中的4项，并且排除其他可以引起类似症状的疾病。病程10 d以内且未使用IVIG治疗，视为急性期KD患儿 。

1.4 KD冠状动脉损伤诊断指标 KD患儿均分别于急性期及IVIG治疗后行心脏彩色多普勒检查。①冠状动脉扩张：<3岁冠状动脉内径﹥2.5 mm，～5岁冠状动脉内径﹥3.0 mm，≥5岁冠状动脉内径﹥4.0 mm；②冠状动脉瘤诊断标准：①冠状动脉内径>4 mm, ≤8 mm；≥ 5岁年长儿冠状动脉扩张的内径为正常的 1.5～4倍, 诊断为冠脉瘤；②巨大冠脉瘤：冠状动脉内径>8 mm； ≥ 5岁年长儿冠状动脉扩张的内径大于正常4倍，诊断为巨大冠脉瘤。

1.5 分组 KD患儿依据IVIG使用前后分为KD组和KD-IVIG组，KD组依据有无冠状动脉损伤分为冠状动脉损伤(KD-CAL+)亚组和无冠状动脉损伤(KD-CAL-)亚组，健康儿童为对照组。

1.6 KD组纳入标准 2015年2月至2016年6月来我院就诊并被诊断为KD急性期的住院患儿。

1.7 对照组纳入和排除标准 同期我院保键科体检的、年龄与KD组尽量匹配的健康儿童，排除先天性心脏病、遗传性疾病等。

1.8 观察指标及检测方法

1.8.1IL-2Rα/β、IL-12Rβ1/2、IL-18Rα/β、TLR4和MyD88基因转录水平检测 采用实时荧光定量PCR方法，① 无菌采集乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA·Na2)抗凝静脉血3 mL，采用免疫磁珠(美国LifeTec公司, 111.45 D)分离CD4+T细胞，并抽提总RNA。② 按试剂盒(美国Thermo公司，K1632)说明， 将总RNA逆转录合成cDNA。③ 根据Genebank中IL-2Rα/β、IL-12Rβ1/2、IL-18Rα/β、TLR4、MyD88和β-actinmRNA序列设计引物(表1 )，分别进行PCR扩增并送交上海英骏生物技术有限公司测序。测序结果与目标序列完全一致。④ 参照SYBR Green试剂盒(德国Qiagen公司，204143)说明定量分析，结果以目的基因/β-actin的比值表示。

表1 实时荧光定量PCR引物

1.8.2IFN-γ基因组蛋白H3乙酰化及乙酰化酶p300和去乙酰化酶HDAC1/2结合水平检测 采用染色质免疫共沉淀(ChIP)，① 用含1%甲醛的PBS重悬部分已分离的CD4+T细胞， 37℃交联10 min。经含1mM PMSF, 1μg·mL-1aprotinin 和1μg·mL-1pepstatin A的冷PBS洗涤2次后，重悬于200 μL SDS裂解液，冰上孵育10 min;。② 采用超声法打断基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳确定片段长度为400～600 bp后，参照染色质免疫共沉淀试剂盒(美国Upstate公司，17-295)说明， 分别加入抗Acetyl-H3、p300和HDAC1/2抗体，分离input DNA和抗体特异性结合DNA。 ③ 根据IFN-γ基因序列设计引物，参照SYBR Green试剂盒(德国Qiagen，204143)说明进行定量分析，分别计算抗Acetyl-H3、p300和HDAC1/2抗体特异性结合DNA与input DNA比值。

1.8.3 血浆IL-2、IL-12和IL-18浓度检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)。KD患儿及对照组儿童空腹6 h后，取外周血2 mL以肝素抗凝，500 g离心10 min，分离上层血浆；参照试剂盒(美国eBioscience公司，BMS221HS*、BMS238HS*和BMS267/2*)说明，检测血浆IL-2、IL-12和IL-18浓度。

1.8.4 Th1细胞比例及IFN-γ、pSTAT4、pSTAT5和T-bet蛋白水平检测 采用流式细胞术检测，① 采用密度梯度离心法分离外周血PBMC，重悬于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，加入20 ng·mL-1PMA、1 μg·mL-1Ionomycin和2 μmol·L-1Monensin刺激6小时；以CD4-eFluro450设门，固定、破膜，经IFN-γ-FITC抗体胞内染色30 min，检测CD4+IFN-γ+(Th1)细胞比例及IFN-γ蛋白表达水平；② 以CD4-eFluro450设门，固定、破膜，经pSTAT4-PE、pSTAT5-Alexa647和T-bet-PE-Cy7抗体核内染色30 min，检测CD4+T细胞pSTAT4、pSTAT5和T-bet蛋白表达水平。所有数据经Diva软件获取分析，蛋白表达水平以平均荧光强度(MFI)表示。

2 结果

2.1 一般情况 符合本文纳入和排除标准的KD患儿38例进入本文分析，其中男20例、女18例，年龄1～5.2岁，平均年龄(2.9±1.3)岁；KD-CAL+亚组16例，KD-CAL-亚组22例。对照组32例，其中男17例，女15例，年龄1.2～4.9岁，平均年龄(2.8±1.3)岁。KD组和对照组年龄(t=0.32，P=0.97) 、性别(χ2=0.002，P=0.97) 差异无统计学意义。

2.2 Th1细胞比例、IFN-γ表达及组蛋白乙酰化检测结果 表2和图1、2显示，经流式细胞术和real-time PCR观察到急性期KD患儿Th1细胞比例及IFN-γ蛋白水平显著增高(P<0.05)，其中KD-CAL+亚组前述二项均高于KD-CAL-亚组(P<0.05)，经IVIG治疗后明显恢复(P<0.05)；进一步分析IFN-γ基因组蛋白H3乙酰化及mRNA水平，发现急性期KD患儿CD4+T细胞IFN-γ组蛋白H3乙酰化及mRNA水平显著增加(P<0.05)，且KD-CAL+亚组IFN-γ组蛋白H3乙酰化及mRNA水平明显高于KD-CAL-亚组 (P<0.05)，经IVIG治疗后均明显恢复(P<0.05)。

表2 KD患儿外周血Th1细胞比例及IFN-γ组蛋白乙酰化相关因子流式细胞检测结果( ±s)

注 1)与对照组比较，P<0.05；2)与KD-CAL-亚组比较P<0.05；3) 与KD组比较，P<0.05

图1 KD患儿Th1细胞及相关分子流式细胞检测结果

注 A：Th1细胞检测结果；B：IFN-γ及其组蛋白乙酰化相关分子检测结果

2.3IFN-γ组蛋白乙酰化/去乙酰化酶检测结果 图2显示，经ChIP检测组蛋白乙酰化酶p300、去乙酰化酶HDAC1/2与IFN-γ基因的结合水平，结果发现，急性期KD患儿CD4+T细胞IFN-γ基因p300结合水平显著增加(P<0.05)，而HDAC1/2结合水平明显降低(P<0.05)，导致p300/HDAC1/2明显高于对照组且与IFN-γ组蛋白H3乙酰化水平呈正相关关系(r=0.52;P<0.05)，经IVIG治疗后均有所恢复(P<0.05)。进一步比较KD-CAL+和KD-CAL-亚组上述各项表达，发现KD-CAL+亚组IFN-γ基因p300结合水平及p300/HDAC1/2比值均高于KD-CAL-亚组 (P<0.05)，而HDAC1/2结合水平则低于后者(P<0.05)。

2.4IFN-γ组蛋白乙酰化相关因子检测结果 表2、3和图1、3显示，急性期KD患儿血浆IL-2、IL-12和IL-18浓度显著增加(P<0.05)，且KD-CAL+亚组IL-2、IL-12和IL-18浓度均高于KD-CAL-亚组(P<0.05)，经IVIG治疗后均有所恢复(P<0.05)。进一步分析炎症因子受体及TLR下游信号分子，发现急性期KD患儿CD4+T细胞表面受体IL-12Rβ1/2、IL-2Rα/β、IL-18Rα/β和TLR4及其下游信号分子pSTAT4、T-bet、pSTAT5和MyD88表达显著上调，且KD-CAL+亚组上述各项均高于KD-CAL-亚组(P<0.05)，经IVIG治疗后均有不同程度恢复(P<0.05)。

图2 KD患儿IFN-γ组蛋白H3乙酰化及p300、HDAC1/2结合水平检测结果

注 A：CD4+T细胞基因组DNA超声破碎琼脂糖凝胶电泳图；B：IFN-γ基因组蛋白乙酰化H3Ac水平及p300、HDAC1/2结合水平检测结果，各组结果经汇总后以直方图形式表示；1)与对照组比较，P<0.05；2)与KD-CAL-亚组比较P<0.05；3) 与KD组比较，P<0.05

表3 KD患儿血浆IFN-γ组蛋白乙酰化相关因子ELISA

注 1)与对照组比较，P<0.05；2)与KD-CAL-亚组比较P<0.05；3) 与KD组比较，P<0.05

3 讨论

KD病因及发病机制仍未完全清楚，大量的临床、流行病学资料和免疫学观察指标提示，KD可能是感染引起急性自身免疫功能紊乱所致[1-3]，但导致KD自身免疫功能异常活化的机制仍有待阐明。Th1是一类介导细胞免疫功能的T细胞亚群，可通过表达FasL直接介导细胞毒作用或分泌细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2等)活化免疫活性细胞而促进机体免疫反应，其数量异常或功能障碍可导致免疫功能紊乱[4-6]。国外报道及本研究显示，急性期KD患儿Th1细胞比例及IFN-γ蛋白表达异常增加，其中KD-CAL+亚组前述二项均明显高于KD-CAL-亚组，经IVIG治疗后明显恢复，提示KD及血管损伤的发病机制可能与Th1细胞数量及功能异常有关，但导致KD患儿Th1细胞数量及功能异常的分子机制仍不完全清楚。

图3 KD患儿IFN-γ组蛋白H3乙酰化相关分子检测结果

注 1)与对照组比较P<0.05，2)与KD-CAL-组比较P<0.05，3)与KD组比较P<0.05

IFN-γ是Th1细胞分泌的标志性分子，在Th1细胞分化、成熟及免疫功能中发挥着至关重要的作用，其表达受细胞因子信号、表观遗传学修饰等多种因素调节[7-9]。组蛋白乙酰化是一种常见的表观遗传学修饰，可将乙酰基转移至组蛋白而使包绕在核小体外围的染色质形成松散、开放的空间结构，从而有利于转录因子的结合并启动基因表达[10,11]。本研究发现急性期KD患儿CD4+T细胞IFN-γ基因组蛋白H3乙酰化及mRNA表达水平显著增加，且KD-CAL+亚组IFN-γ基因组蛋白H3乙酰化及mRNA水平均高于KD-CAL-亚组，经IVIG治疗后均明显恢复，提示IFN-γ基因组蛋白过度乙酰化可能是导致急性期KD患儿Th1细胞数量及功能异常的重要因素之一。

调节IFN-γ基因组蛋白乙酰化的分子机制仍未完全阐明。p300是一种组蛋白乙酰化酶，可在辅因子CBP协助下，催化IFN-γ基因组蛋白发生乙酰化[8,13-15]。而去乙酰化酶HDAC1/2与Sin3A等蛋白形成免疫复合物Sin3A-HDAC1/2，后者结合至IFN-γ基因序列并促使组蛋白发生去乙酰化，从而参与调节IFN-γ基因组蛋白乙酰化水平[16]。本研究发现急性期KD患儿CD4+T细胞IFN-γ基因p300结合水平显著增加，而HDAC1/2结合水平明显降低，导致p300/HDAC1/2比值明显高于对照组且与IFN-γ组蛋白H3乙酰化水平呈正相关关系，经IVIG治疗后均有所恢复。进一步比较发现KD-CAL+亚组IFN-γ基因p300结合水平及p300/HDAC1/2比值均高于KD-CAL-亚组，而HDAC1/2结合水平则低于后者，提示IFN-γ基因组蛋白过度乙酰化可能与p300和HDAC1/2的结合水平异常有关。既往的研究已证实IL-12可与靶细胞表面受体结合，诱导下游信号分子STAT4发生磷酸化并募集T-bet、p300/CBP共同结合至IFN-γ基因序列，促使与IFN-γ基因结合的Sin3A-HDAC1/2发生解离，从而催化相关的组蛋白发生乙酰化[8,13-15]。与此相类似的是，IL-2亦可通过下游信号分子STAT5募集p300/CBP而介导IFN-γ基因组蛋白乙酰化[17,18]。另有研究表明IL-18刺激或TLR4信号可通过其共同的下游信号促进p300的表达及乙酰化酶活性并抑制HDAC1/2去乙酰化酶活性，从而增强IFN-γ基因组蛋白乙酰化水平[8,19-21]。而静脉注射IVIG经Fc段与细胞表面受体结合，可通过抑制DC成熟和炎症细胞因子的产生、下调TLR受体表达等机制介导抗炎作用，从而维持免疫系统动态平衡[22,23]。为探讨导致KD患儿IFN-γ基因p300和HDAC1/2结合水平异常的可能分子机制及IVIG的药物动力学影响，本研究比较了各组血浆IL-12、IL-2和IL-18浓度，发现急性期KD患儿IL-12、IL-2和IL-18浓度显著增高，且KD-CAL+亚组IL-12、IL-2和IL-18浓度均高于KD-CAL-亚组，经IVIG治疗后均有所恢复。进一步分析炎症因子受体及TLR下游信号分子的表达，发现急性期KD患CD4+T细胞表面受体IL-12Rβ1/2、IL-2Rα/β、IL-18Rα/β和TLR4及其下游信号分子pSTAT4、T-bet、pSTAT5和 MyD88表达显著上调，且KD-CAL+亚组前述各项均高于KD-CAL-亚组，经IVIG治疗后均有不同程度恢复，提示炎症因子及TLR信号过度活化可能是导致急性期KD患儿IFN-γ基因p300和HDAC1/2结合水平异常的关键因素，而IVIG或可通过抑制炎症因子及TLR4信号而调节p300、HDAC1/2结合水平。

基于上述结果，推测感染因素触发了KD患儿细胞因子级联反应，导致IL-12、IL-2和IL-18等炎症因子的大量产生，造成组织损伤并释放内源性配体。在炎症因子及内、外源性配体诱导的TLR4信号的共同作用下IFN-γ基因组蛋白乙酰化酶p300结合水平明显增加，而去乙酰化酶HDAC1/2结合水平显著降低，从而促使IFN-γ基因组蛋白过度乙酰化而上调其表达，最终导致Th1细胞数量及功能异常。而IVIG可通过抑制炎症因子及TLR4信号调节IFN-γ基因组蛋白乙酰化酶p300、HDAC1/2结合水平，进而促进IFN-γ表达及Th1细胞恢复。但组蛋白乙酰化是一种较为复杂的酶促动力学过程，是否存在其他因素参与调节IFN-γ基因组蛋白乙酰化仍有等进一步研究。

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(本文编辑：张崇凡，孙晋枫)

Changesandsignificancesofhistone3acetylationofIFN-γgeneduringacutephaseofKawasakidisease

MEIJie-hua1,3,CUIDong1,3,WANGQin2,WENPeng-qiang1,XUMing-guo1,TANGGen1,LIUCong1,LICheng-rong1,WANGGuo-bing1

(1ShenzhenInstituteofPediatrics,ShenzhenChildren'sHospital,ZunyiMedicalCollege,Shenzhen518038,China; 2LabCentre,ShenzhenMaternity&ChildHealthcareHospital,SouthernMedicalUniversity,Shenzhen518028,China; 3hasequalcontribution)

Corresponding Author：WANG Guo-bing, E-mail: rogasan@163.com

ObjectiveTo investigate the changes and significances of histone 3 acetylation ofIFN-γgene in patients with acute Kawasaki disease(KD). MethodsChildren with KD were enrolled in Shenzhen Children's Hospital from February 2015 to June 2016, and sub-grouped as with or without coronary artery lesions (CAL). Age-matched healthy children attending routine physical examination were recruited as controls during the same period. Chromatin immunoprecipitation was performed to determine acetylation level of histone 3 ofIFN-γgene, and binding level of histone acetyltransferase p300 and deacetylase HDAC1/2 withIFN-γgene. The proportion of CD4+IFN-γ+ cells (Th1) and protein levels of IFN-γ, pSTAT4, pSTAT5 and T-bet were analyzed by flow cytometry. Quantitative real-time PCR was used to evaluate the levels ofIFN-γ,IL-2Rα/β,IL-12Rβ1/2,IL-18Rα/βandITLR4 mRNA in CD4+T cells. Plasma concentrations of IL-12, IL-2 and IL-18 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Results① Thirty-eight children with KD, including 16 children with CAL (KD-CAL+) and 22 children without CAL(KD-CAL-), aged from 1 to 5.2 years with a mean of 2.9 years were recruited. The KD group consisted 20 males and 18 females, and 32 age-matched healthy children with 17 males were recruited as controls. No difference of age or sex was found between the two groups(P>0.05). ② The proportion of Th1, expression levels of IFN-γ protein and mRNA, and acetylation levels of histone 3 ofIFN-γgene increased remarkably during acute KD(P<0.05), and restored after IVIG therapy(P<0.05). Meanwhile, all the four items aforementioned in KD-CAL+ subgroup were higher than those in KD-CAL- subgroup (P<0.05). ③ During acute KD, binding level of p300 withIFN-γgene was up-regulated significantly whereas binding level of HDAC1/2 withIFN-γgene was down-regulated(P<0.05), resulting in the higher ratio of p300/HDAC1/2 that was positive correlated with the acetylation level ofIFN-γgene in patients in acute KD(r=0.52,P<0.05). Moreover, binding level of p300 withIFN-γgene and the ratio of p300/HDAC1/2 in KD-CAL+ subgroup were higher than those in KD-CAL- subgroup (P<0.05), while a lower binding level of HDAC1/2 withIFN-γgene was found in KD-CAL+ subgroup (P<0.05). All the three items mentioned above restored remarkably after IVIG treatment(P<0.05). ④ In comparison with healthy controls, plasma concentration of inflammatory cytokines (IL-2, IL-12 and IL-18), expression levels of their receptors(IL-2Rα/β, IL-12Rβ1/2, IL-18Rα/β and TLR4) and downstream molecules (pSTAT5, pSTAT4, T-bet and MyD88) were elevated pronouncedly during acute KD(P<0.05), and restored to some extent after IVIG treatment (P<0.05). Simultaneously, all the items mentioned before in KD-CAL+ subgroup were higher than those in KD-CAL- subgroup (P<0.05). ConclusionHyper-acetylation of histone ofIFN-γgene might be one of the important factors contributing to immune dysfunction of KD.

Kawasaki disease; IFN-γ; Histone acetylation; T helper cell 1 type; Immune

国家自然科学基金：81102227，81300124；深圳市科技计划项目：JCYJ20140416141331464， JCYJ20140416141331478，JCYJ20150403100317055；深圳市卫生计生系统科研项目：201401053，201402042，201501032资助

1 遵义医学院深圳市儿童医院儿科研究所 深圳，518038；2 南方医科大学附属深圳市妇幼保健院中心实验室 深圳，518028；3 并列第一作者

王国兵，E-mail: rogasan@163.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2016.06.002

2016-10-12

2016-12-18)