克罗恩病和健康儿童血清细胞因子水平的病例对照研究

卢华君 赵忠艳 李小莉 闫秀梅 林小春 黄开宇

·论著·

克罗恩病和健康儿童血清细胞因子水平的病例对照研究

卢华君 赵忠艳 李小莉 闫秀梅 林小春 黄开宇

目的 观察克罗恩病(CD)患儿血清细胞因子水平，探讨细胞因子水平紊乱在儿童克罗恩病发病中的作用。方法 纳入2013年1月至2015年12月在温州医科大学育英儿童医院(我院)儿内科住院的确诊CD患儿(病例组，根据CD活动度分为不同亚组)和同期在我院门诊体检的健康儿童，采用流式分析技术检测晨起空腹静脉血血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和IL-17A的水平。结果 病例组32例，男18例，女14例，年龄(8.5±4.3)岁，其中CD轻度活动亚组12例，CD中重度活动亚组20例；对照组30名，男18名，女12名，年龄(10±3.5)岁。病例组和对照组年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。病例组患儿血清IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和IL-17A水平高于对照组，血清IL-10和IFN-γ水平低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。此外，根据儿童CD活动指数(PCDAI)评分为中重度活动亚组患儿的血清IL-2、TNF-α和IL-17A水平高于轻度活动亚组患儿，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 与健康儿童相比，CD患儿存在明显的免疫相关细胞因子水平变化，而且疾病活动度不同其细胞因子水平亦有差异，提示细胞因子水平紊乱在儿童CD发病及病情的发展中有重要作用。

克罗恩病； 细胞因子； 流式细胞术； 儿童

克罗恩病(CD) 是一种非特异性的消化道炎症性疾病。CD发病机制目前仍不完全清楚，既往研究支持CD是一种肠道免疫平衡失调的表现，且辅助性T细胞(Th)是主要的参与者。TNF-α在CD发病中的重要作用受到广泛关注，但其他细胞因子是否参与发病目前还不清楚。CD临床表现复杂，病变可累及消化道的各个部位，特别是末段回肠

和结肠，也可累及全身各个系统。儿童CD的诊断和治疗方案大多借鉴于成人方案，但临床发现其与成人CD又有着不同之处。用于儿童CD治疗的药物包括氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、免疫抑制剂及生物制剂，但不同患儿药物治疗的疗效个体差异很大，且目前尚无统一且绝对有效的治疗方案[1]。如果能深入探讨CD患儿的免疫应答变化，将有助于阐明儿童CD的发病机制及进行个体化免疫干预治疗。

1 方法

1.1 研究设计 采用病例对照研究设计。观察CD患儿(病例组，根据CD活动度分为不同亚组)和正常儿童(对照组)血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和L-17A的水平。

1.2 儿童CD的诊断标准[1]诊断依靠临床、影像、内镜表现和病理检查结果综合判断。影像学和内镜检查：①非连续性节段性病变，②铺路石表现或纵行溃疡，③全壁炎症病变；组织病理或大体标本：④非干酪肉芽肿、裂隙溃疡，⑤瘘管，⑥肛门部病变。符合①～③拟诊CD；拟诊CD+符合⑤～⑥中任何1项为确诊CD；符合④项+①～③中任何2项确诊CD。

1.3 CD活动度评价 依据儿童CD活动指数 (PCDAI)进行评分。评分项目包括腹痛、每日便次、一般情况、体重、身高(诊断时)或身高速率、腹部情况、肛旁疾病、肠外疾病、红细胞压积、血沉及白蛋白水平11个项目，每个项目非等距赋分，0、2、5或10分。11～30分为轻度活动(轻度活动亚组)，≥31分为中/重度活动(中重度活动亚组)。

1.4 病例组纳入和排除标准 2013年1月至2015年12月在温州医科大学育英儿童医院(我院)儿内科住院的达确诊标准的CD患儿，且排除其他慢性肠道感染性疾病、肠结核、肠道恶性淋巴瘤或自身免疫性疾病者。

1.5 对照组纳入和排除标准 在病例组全部病例入组完成后依据病例组的年龄、性别构成按比例选取健康对照组，所有对照组对象均为我院门诊体检的健康儿童，排除急性病毒感染、慢性肠道感染性疾病、结核感染或严重肝肾心功能不全者。

1.6 伦理和知情同意 血液标本的取得病例组患儿和对照组儿童家属同意。对照组儿童血清标本均为到我院就诊行血液检查或体检血生化时取得。

1.7 观察指标及其检测方法 观察指标为血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和IL-17A水平。病例组和对照组儿童晨起空腹用干燥试管采集静脉血2 mL，离心取血清用EP管分装，置-80℃冰箱保存备用。细胞因子检测方法采用流式微球分析(CBA)技术，检测方法参考文献[2]。检测试剂盒由BD公司提供。

2 结果

2.1 一般情况 符合本文纳入排除标准的CD患儿32例进入本文分析，男18例，女14例，年龄7～15(8.5±4.3)岁。对照组30名健康儿童进入本文分析，男18名，女12名，年龄6～13(10±3.5)岁。两组年龄(t=1.87,P>0.05)、性别(χ2=0.096,P>0.05)差异无统计学意义。根据PCDAI评分，轻度活动亚组12例，中重度活动亚组20例。

32例CD患儿均行腹部B超检查，其中17例有明显的肠壁增厚、12例有肠管节段性扩张、3例右下腹肿块。6例行胃肠道超声检查未发现异常。8例行全胃肠道钡剂造影，其中5例主要表现为肠黏膜紊乱，肠壁节段性增厚、狭窄、僵硬；2例结肠结节状充盈缺损；1例肠管扩张，肠间隙增宽，结肠袋形消失。

32例CD患儿均行结肠镜检查，其中21例肠黏膜局灶性充血、水肿、糜烂、片状或纵形溃疡形成，部分黏膜可有结节样或息肉样增生表现；8例明显鹅卵石样表现；3例结肠多发息肉。2例行胶囊内镜检查示，小肠黏膜多发充血水肿溃疡、多发息肉样隆起，小肠中上段多发裂隙样溃疡和鹅卵石样改变。

32例CD患儿均以结肠镜活检组织行病理检查，均示肠黏膜固有层疏松水肿，大量淋巴细胞、浆细胞和嗜酸性粒细胞浸润，3例非干酪样肉芽肿。

2.2 病例组与对照组血清细胞因子水平比较 图1和表1示，病例组患儿血清IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和IL-17A水平高于对照组，而血清IL-10和IFN-γ水平则明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。病例组不同活动度亚组血清细胞因子水平比较，血清IL-2、TNF-α和IL-17A水平中重度活动亚组高于轻度活动亚组(P<0.05)，血清IL-4、IL-6、IL-10和IFN-γ水平在两个亚组差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 病例组和对照组血清细胞因子流式细胞术检测结果

注t1和p1：病例组与对照组比较；t2和p2：中重度活动亚组与轻度活动亚组比较

3 讨论

既往研究[3]认为CD是一种肠道免疫平衡失调的表现。肠道的免疫平衡由调节性T细胞和免疫性T细胞调控。免疫性T细胞分为辅助性T细胞(Th)和细胞毒性T细胞。Th在不同细胞因子的刺激下可以分为Th1和Th2。Th1型细胞主要分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α等；Th2型细胞主要分泌IL-4、IL-6和IL-10等。目前认为，CD的发病是以Th1介导为主。Th1型细胞分泌的TNF-α已引起广泛关注，它是CD发病中一个重要的促炎因子。动物研究发现，去除小鼠T细胞TNF-α基因的3’非翻译区会导致TNF-α水平升高并产生CD样的表型，形成节段性累及肠壁全层的肉芽肿性肠炎。

IFN-γ是最典型的Th1型细胞因子，具有抗炎症活性，其降低可能导致机体抵抗炎症反应的能力降低。Th17细胞是一群新近鉴定的CD4+效应T细胞，该细胞分泌IL-17A、IL-17F、IL-6和IL-23等细胞因子，具有很强的促炎症作用。其中最主要的是IL-17A，它与Th1、Th2和调节性T细胞一起广泛参与了机体的免疫防御及免疫调节过程。IL-17可能通过激活细胞因子、趋化因子，增加TNF-α诱导的消化道平滑肌细胞的IL-6表达，从而促进中性粒细胞的成熟和激活。Strober等[4]研究发现，在CD患者炎症肠道黏膜中，Th1相关的细胞因子(如TNF-α、IFN-γ)和Th17相关细胞因子(如IL-17A)显著升高。本研究中CD患儿血清IFN-γ和IL-10明显低于对照组，而IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和IL-17A水平则明显高于对照组。与对照组儿童相比，CD患儿血清IL-10浓度降低，提示可能由于存在某种因素抑制了IL-10的产生，导致不能削弱机体的细胞免疫反应，细胞因子网络失衡。由于IL-4的异常升高可刺激B细胞分泌IgE，而IFN-γ是一个IgE合成的潜在抑制物，那么IL-4与IFN-γ的失衡就可能使患儿IgE水平增高，从而引起了一系列肠黏膜炎症改变。CD患儿血清IL-2水平的升高可能与多种细胞因子水平的变化并相互诱生有关。CD患儿巨噬细胞合成并分泌大量TNF-α，直接损伤血管内皮细胞，加重消化道组织的损伤。消化道组织的损伤又促使TNF-α因子的释放，形成恶性循环，造成消化道炎症反应的反复发生和迁延不愈。本研究发现CD患儿血清细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-17A较对照组显著升高，而且中重度活动CD患儿血清TNF-α、IL-2和IL-17A水平显著高于轻度活动CD患儿，而IFN-γ、IL-4、IL-6及IL-10水平则无显著性差异。提示TNF-α、IL-2和IL-17A在儿童CD疾病发展及活动中可能起重要作用。

儿童CD的治疗目前尚无统一且绝对有效的方案。除了一般营养治疗外，糖皮质激素、5氨基水杨酸(5-ASA)、6-巯基嘌呤、柳氮磺吡啶、美沙拉秦和沙利度胺等均可用于儿童CD的治疗。有研究者认为，CD患儿在患病早期应用抗TNF-α制剂治疗的效果优于一般免疫治疗[3]。英夫利西(IFX)为抗TNF-α单克隆抗体，可通过与巨噬细胞和T细胞表面表达的TNF-α高亲和力结合而拮抗TNF-α的生物活性。通过抗体依赖性细胞毒作用、补体依赖性细胞毒作用以及影响细胞的信号转导途径，最终加速细胞周期阻滞、凋亡以及抑制细胞因子产生[5]。

本研究结果提示，与健康儿童相比，CD患儿存在血清细胞因子水平紊乱，不同疾病活动度的CD患儿细胞因子水平亦有差异，提示细胞因子水平紊乱在儿童CD发病及病情的发展中有重要作用。

[1] 中华医学会儿科学会消化学组儿童炎症性肠病协作组，陈洁, 许春娣, 等. 儿童炎症性肠病诊断规范共识意见. 中国实用儿科杂志, 2010, 25(4): 263-265

[2] 卢华君，赵忠艳，李云芳，等. 呼吸道腺病毒感染患儿细胞因子及淋巴细胞亚群的研究.中国人畜共患病学报, 2013, 29(8): 808-816

[3] Walters TD, Kim MO, Denson LA, et al. Increased effectiveness of early therapy with anti-tumor necrosis factor-α vs an immunomodulator in children with Crohn's disease. Gastroenterology, 2014, 146(2): 383-391

[4] Strober W, Fuss IJ. Proinflammatory cytokines in the pathogenesis of inflammatory bowel diseases. Gastroenterology, 2011, 140(6): 1756-1767

[5] 吴芳，占强. 英夫利西单抗治疗克罗恩病中免疫平衡及细胞因子的变化和意义. 医学综述, 2012, 18(23): 3947-3949

(本文编辑：张崇凡)

Acase-controlstudyofserumlevelsofcytokinesinCrohn'sdiseaseandhealthychildren

LUHua-jun,ZHAOZhong-yan,LiXiao-li,YANXiu-mei,LINXiao-chun,HuangKai-yu

(DepartmentofPediatricGastroenterology,YuyingChildren'sHospital,Wenzhou325027,China;TheSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China)

Corresponding Author：HUANG Kai-yu，E-mail: hky3027256@163.com

ObjectiveTo detect the serum levels of cytokines in children with Crohn's disease (CD), in order to explore the role of cytokine levels disorder on the pathogenesis of CD in children.MethodsHospitalized CD patients diagnosed between January 2013 and December 2015 in Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University (Case group was divided into different subgroups according to CD activity)，and outpatient healthy children at the same period were enrolled as case group and control group, respectively. The levels of serum IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ, and IL-17A were detected by flow cytometry in the morning with an empty stomach. ResultsThere were 32 cases of children with CD in case group, including 18 males, 14 females, with average age of (8.5±4.3) years; 12 cases in mild activity CD subgroup, 20 cases in moderate and severe activities CD subgroup.There were 30 healthy children in control group, including 18 males and 12 females , with average age of (10±3.5) years. There was no statistically significant difference in age and gender between case group and control group(P>0.05).The levels of serum IL-2, IL-4, IL-6, TNF-α, and IL-17A in case group were significantly higher than those in the control group (P<0.05). And the levels of serum IL-10 and IFN-γ in case group were significantly lower than those in the control group (P<0.05). In addition，the levels of serum TNF-α, IL-2 and IL-17A in moderate and severe activities CD subgroup identified by the pediatric CD activity index (PCDAI) were significantly higher than those in mild activity CD subgroup (P<0.05).ConclusionCompared with healthy children, CD children existed obvious immune related cytokines level change.With the change of CD activity, the levels of cytokines were also different. It suggested that cytokine levels disorder played an important role in the development of CD in children.

Crohn's disease; Cytokine; Flow cytometry; Children

1温州医科大学附属第二医院 温州，325027；2育英儿童医院儿童消化科 温州，325027

黄开宇，E-mail: hky3027256@163.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2016.06.012

2016-10-27

2016-11-18)