加味苓桂术甘汤对肾纤维化大鼠肾组织TGF-β1表达的影响

董小君　丁　斗　刘厚颖　王玲玲

1.遵义医药高等专科学校中医系，贵州　遵义　563002；2.成都中医药大学基础医学院，四川　成都　610075；3.贵阳中医学院第二附属医院，贵州　贵阳　550002



加味苓桂术甘汤对肾纤维化大鼠肾组织TGF-β1表达的影响

董小君1，2丁斗1∆刘厚颖3王玲玲3

1.遵义医药高等专科学校中医系，贵州遵义563002；2.成都中医药大学基础医学院，四川成都610075；3.贵阳中医学院第二附属医院，贵州贵阳550002

【摘要】目的：观察加味苓桂术甘汤对大鼠肾纤维化模型的影响，并探讨其可能的作用机制。方法：将40只Wistar雄性大鼠随机分为4组：正常对照组、模型对照组、低剂量加味苓桂术甘汤组与高剂量加味苓桂术甘汤组。按200mg/(kg·d)腺嘌呤灌胃建立大鼠肾纤维化模型。28d后采集血液标本，检测大鼠血清BUN、Cr水平的变化；留取肾组织，用于HE染色观察肾组织病理改变及免疫组化方法检测肾组织TGF-β1的表达。结果：模型对照组血清BUN、Cr、肾组织TGF-β1较正常对照组明显升高，加味苓桂术甘汤各组上述指标较模型对照组明显下降。结论：加味苓桂术甘汤可保护肾功能，通过下调TGF-β1表达延缓肾纤维化进展。

【关键词】加味苓桂术甘汤；肾纤维化；TGF-β1

肾纤维化(renal fibrosis，RF)是不同病因的慢性肾病进展到终末期肾衰竭的共同通路和病理基础，其发生机制错综复杂，涉及细胞、细胞外基质和生长因子之间的相互作用[1]。其中，转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是目前公认的最强致纤维化因子，细胞外基质的沉积与之密切相关，是促进肾脏疾病进展的重要因素。苓桂术甘汤源自《金匮要略·痰饮咳嗽病脉证并治》，原为中阳不足之痰饮而设，以温阳化饮，健脾利湿为用。课题组根据多年临床经验，在原方基础上，拟定出具有补肾健脾、通络消癥功效的加味苓桂术甘汤。临床上用该方治疗慢性肾脏病，取得了较好的疗效。为进一步探讨加味苓桂术甘汤对肾纤维化的影响，本研究用腺嘌呤灌胃制作大鼠肾纤维化模型，通过观察加味苓桂术甘汤对肾组织TGF-β1的影响，从细胞分子水平探讨该方抑制肾纤维化的作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物雄性Wistar大鼠40只，体重200～250g，清洁级，由贵州医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(黔)2012-0001。

1.2药品与试剂加味苓桂术甘汤由土茯苓、桂枝、白术、炙甘草、法半夏、黄连、大黄、六月雪、淫羊藿、熟地、黄芪、太子参、三七、丹参、当归、车前子、川芎等组成，以上中药均购自贵阳中医学院第二附属医院门诊草药局，制成低剂量含生药量1.48g/ml与高剂量含生药量2.96g/ml的中药水煎液，4℃恒温冰箱保存；腺嘌呤购自昆明腾科科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒，TGF-β1兔抗鼠多克隆抗体，SABC免疫组织化学试剂盒，DAB显色剂，购自武汉博士德生物有限公司。

1.3动物分组与实验方法将40只雄性Wistar大鼠随机分为4组，分别为正常对照组(Ⅰ组)、模型对照组(Ⅱ组)、低剂量加味苓桂术甘汤组(Ⅲ组)与高剂量加味苓桂术甘汤组(Ⅳ组)。造模根据文献报道[2]，结合预实验，制备浓度为2.5%的腺嘌呤混悬液(每1g腺嘌呤溶于40ml生理盐水)，按200mg/(kg·d)腺嘌呤给模型对照组和低剂量、高剂量加味苓桂术甘汤组连续灌胃28d(正常对照组给予同等剂量的生理盐水)，诱发肾纤维化模型。实验第8天开始进行中药预防干预，用药剂量按照施新猷[3]动物与人的药物剂量换算方法换算得出，低、高剂量加味苓桂术甘汤组分别按生药22.2、44.4g/(kg·d)灌胃，持续给药3周，正常对照组与模型对照组每天给予3ml的生理盐水。

1.4标本采集与指标检测实验第29天采集标本，采集标本前禁水12h，禁食8h。将全部大鼠用10%戊巴比妥钠麻醉后，股动脉取血5ml，静置20min，3000r/min离心10min后分离血清，用全自动生化分析仪测血尿素氮(BUN)，血肌酐(Cr)含量。采血后即刻摘取大鼠肾脏，放入10%中性甲醛中固定，常规脱水石蜡包埋，用于HE染色及免疫组织化学检查。免疫组化结果应用麦克奥迪数码医学图像分析系统进行半定量分析[4]，每组选10张切片，每张切片在200倍光镜下随机检测10个不重叠视野，视野内棕黄色染色区域为阳性表达，以TGF-β1阳性颗粒的平均光密度来反映 TGF-β1的表达水平。

2结果

2.1对大鼠一般情况的影响实验第8天开始，模型对照组大鼠出现精神萎靡，食欲下降，体质量增长缓慢，毛色干枯，耳廓苍白，目色淡红，眯眼，眼睑浮肿，尾巴湿冷，行动迟缓等现象。低、高剂量大鼠的精神状态优于模型对照组。正常对照组大鼠精神状态良好，摄食正常，毛色光亮，耳廓红润，活动度大。实验过程中，模型对照组与低剂量加味苓桂术甘汤组，各死亡1只动物。

2.2肾功能的检测与正常对照组比较，模型对照组、低剂量加味苓桂术甘汤组大鼠血清BUN、Cr水平显著或极显著升高(P<0.05，P<0.01)；与模型对照组比较，低、高剂量加味苓桂术甘汤组血清BUN、Cr水平极显著下降(P<0.01)；加味苓桂术甘汤各组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3病理学检测光镜下模型对照组与各加味苓桂术甘汤组大鼠肾组织均有不同程度的损伤，其中模型对照组损伤最重，高剂量加味苓桂术甘汤组损伤最轻。正常对照组肾小球、肾小管及肾间质未见异常。模型对照组肾小管上皮细胞弥漫空泡变性，纤维组织增生及炎细胞浸润，近球小管管腔内见异物结晶体，结晶体呈放射状，有金属光泽，部分皮质间质内可见中性粒细胞进入，部分肾小管管腔内也见中性粒细胞堆积。低剂量加味苓桂术甘汤组肾脏病变较模型对照组减轻，少许肾小管上皮细胞肿胀，肾间质内炎性细胞呈小灶状浸润，纤维组织增生面积较小且局限。高剂量加味苓桂术甘汤组肾脏病理改变较模型对照组明显减轻，肾间质未见明显纤维化。见图1。

组别nBUN/mmol/LCr/μmol/LI组1013.09±1.24 67.40±4.37 II组936.38±3.57##160.18±20.75## III组916.33±0.91#△△ 81.40±3.33#△△IV组1014.27±1.62△△75.68±5.17△△

注：与Ⅰ组比较，#P<0.05，##P<0.01；与Ⅱ组比较，△△P<0.01。

2.4TGF-β1表达半定量分析与正常对照组比较，余各组TGF-β1表达均明显升高(P<0.01)；与模型对照组比较，加味苓桂术甘汤各组均显著下降(P<0.01)；加味苓桂术甘汤各组间TGF-β1差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2　各组大鼠肾组织TGF-β1表达比较　

组别nTGF-β1(平均积分光密度)I组109.49±0.50II组9151.94±15.52##III组988.40±16.74##△△IV组1084.80±10.73##△△

注：与Ⅰ组比较，##P<0.01；与Ⅱ组比较，△△P<0.01。

3讨论

中医认为，肾纤维化属于“溺毒”、“关格”、“水肿”等范畴[5]，其主要病机为脾肾亏虚、湿浊内蕴、瘀毒壅滞。课题组根据多年临床经验总结出具有补肾健脾、通腑泄浊、活血祛瘀功效的加味苓桂术甘汤。方中黄芪、太子参、茯

苓、白术益气健脾，促进脾胃运化和气机升降恢复；熟地、淫羊藿、桂枝补肾填精温阳；大黄、黄连、车前子、半夏、六月雪利湿祛毒；当归、丹参、三七、牛膝、川芎养血活血化瘀。诸药合用，共奏扶正祛邪，通络消癥之效。通过临床观察发现该方能够缓解慢性肾衰患者临床症状和体征，降低血清尿素氮、肌酐水平，改善肾小球滤过率。

多种细胞因子参与了肾纤维化的病理过程，主要影响肾小管细胞增生、肥大、凋亡及细胞外基质(ECM)合成等。其中，TGF-β1是促进ECM合成与沉积的重要因子， 促进肾小管上皮细胞转化，打破肾间质细胞外基质代谢的动态平衡，使其向纤维化方向发展。TGF-β1几乎参与肾纤维化的各个环节，是诱导肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞的中心环节。因此对抗TGF-β1以阻止肾脏纤维化对治疗慢性肾功能衰竭具有重要意义，也成为一个公认的治疗靶点[6]。

研究通过加味苓桂术甘汤治疗肾纤维化大鼠及其对肾组织TGF-β1表达发现，加味苓桂术甘汤能降低肾纤维化大鼠血清BUN、Cr水平，且高剂量加味苓桂术甘汤组效果更明显。同时，经腺嘌呤灌胃后，模型对照组大鼠肾脏组织均出现不同程度的纤维化，TGF-β1呈现过度表达状态，而用加味苓桂术甘汤干预后的各组TGF-β1表达均明显减少，表明加味苓桂术甘汤可明显保护肾功能，通过下调肾组织内的TGF-β1表达，降低细胞外基质合成，从而延缓肾纤维化的进展。

参考文献

[1] 刘燕霞，史国辉．肾康注射液对腺嘌呤致肾间质纤维化的预防机制[J]．中国医学前沿杂志，2012，4(9)：47-51．

[2] 邱模炎，姜岳，赵宗江，等．真武汤抗大鼠肾间质纤维化作用的研究[J]．中国实验方剂学杂志，2010，16(17)：177-180．

[3] 施新猷．现代医学实验动物学[M]．北京：人民军医出版社，2000：332-335.

[4] 魏仲南，朱淑瑜，杜锐格．补肾祛毒汤对腺嘌呤肾衰竭大鼠肾脏-β1、HGF表达的干预作用[J]．中国中西医结合肾病杂志，2012，13(4)：326-328.

[5] 梁亮，崔长乐，何学红．参芪泄浊饮对腺嘌呤肾间质纤维化模型大鼠肾组织 MMP-9、TIMP-1基因表达的影响[J]．辽宁中医杂志，2015，42(1)：190-193．

[6] 雷根平，王婷，任艳芸，等．加味薯蓣丸对腺嘌呤所致慢性肾功能衰竭大鼠TGF-β1的影响[J]．时珍国医国药，2012，23(9)：2224-2226．

基金项目：遵义科技局青年人才项目(遵市科合社字[2012]30号)。

作者简介：董小君(1983-)，女，江苏靖江人，讲师，2015级博士研究生，主要从事方剂功效发挥机理及应用的研究。E-mail：57229463@qq.com. 通信作者：丁斗(1980-)，男，贵州遵义人，副教授，主要从事中医内科学。E-mail：dingdou1980@sina.com

【中图分类号】R285.5

【文献标志码】A

【文章编号】1007-8517(2016)12-0053-02

(收稿日期：2016.04.18)

Effects of Jiawei Lingguizhugan Decoction on Expression of TGF-β1 in Renal Fibrosis Rats

DONG Xiaojun1,2DING Dou1∆LIU Houying3WANG Lingling3

1.Traditional Chinese Medical Department of Zunyi Medical College，Zunyi 563002，China；2.Basic Medical College of Chengdu University of TCM，Chengdu 610075，China；3.The second Affiliated Hospital of Guiyang Traditional Chinese Medical College，Guiyang 550002，China

Abstract:Objective To observe the effects of Jiawei Lingguizhugan decoction in renal fibrosis rats and explore its possible mechanism. Methods 40 Wistar rats were randomly divided into four groups，namely the control group，the model group，the low-dose Jiawei Lingguizhugan decoction group and the high-dose Jiawei Lingguizhugan decoction group. The models of renal fibrosis were established by intragastric administration of adenine200mg/(kg·d). The blood samples were collected after 28 days. The changes of blood urea nitrogen and creatinine were detected. The kidney pathological changes were observed by light microscopy with HE-staining. The expression of TGF-β1 was determined by immunohistochemical method. Results Blood urea nitrogen，creatinine and TGF-β1 of the model group were markedly increased than that of the control group. The above indicators were lower in the low-dose and high-dose Jiawei Lingguizhugan decoction groups than those in the model group. Conclusions Jiawei Lingguizhugan decoction could protect the kidney function and postpone renal fibrosis by decreasing the expression of TGF-β1 in renal tissues.

Key words:Jiawei Lingguizhugan Decoction；Renal Fibrosis；TGF-β1