氯化镁对大鼠坐骨神经断端再生微结构的作用研究

李明　宋永周　曹舒兴　王斌　童九辉　李秋童　马维



·论著·

氯化镁对大鼠坐骨神经断端再生微结构的作用研究

李明宋永周曹舒兴王斌童九辉李秋童马维

050000石家庄市，河北医科大学第二医院骨科

【摘要】目的研究氯化镁对大鼠坐骨神经损伤后超微结构修复的作用。方法将90只SD大鼠随机分为氯化镁组(MgCl2组)，神经生长因子组(NGF组)，0.9%氯化钠组(NaCl)组，每组30只。制作坐骨神经缺损模型，分别以硅胶管桥接坐骨神经缺损，构成神经再生室。分别将1 mmol/L MgCl2、NCF、0.9%氯化钠溶液分别注入神经再生室中。于术后4、8、12周处死动物，取出神经再生室中断端再生组织，固定处理后通过光镜观察再生神经纤维数目及再生纤维神经截面积，电镜观察神经再生室中雪旺细胞增殖和发育情况、髓鞘的超微结构。结果MgCl2组和NGF组术后4、8、12周再生神经纤维数目和再生神经纤维截面积高于NaCl组，差异有统计学意义(P<0.05)，而MgCl2组与NGF组比较，差异无统计学意义(P<0.05)。MgCl2组和NGF组新生神经纤维再生数量增多，雪旺细胞增生明显，形态接近正常，髓鞘厚度均匀增加，鞘层分离不明显，神经膜细胞及轴浆有轻度变性，NaCl组神经纤维再生不明显，髓鞘结构模糊，扭曲，雪旺细胞增生不明显，表型幼稚。结论氯化镁可促进大鼠坐骨神经损伤修复后超微结构的修复。

【关键词】氯化镁;雪旺细胞;神经生长因子;坐骨神经损伤

周围神经损伤占全身创伤的3%～10%[1]，具有致残率高，治疗费用高等特点。全球每年约发生1百万例周围神经损伤。仅在美国，每年需花费约1.50亿美金用于治疗神经损伤[2]。周围神经损伤后，局部神经发生继发的氧化应激及变性，神经断端周围微环境恶化，造成神经二次损伤，导致神经功能恢复缓慢。氯化镁具有促进脊髓损伤修复的作用，可以促进轴突再生[2]。而且在临床上广泛应用，毒副作用较小。但是对镁离子的研究集中在中枢神经系统。镁离子对周围神经损伤的作用尚未能知。如果能够证实局部应用氯化镁能够稳定神经损伤后的微环境，促进神经细胞再生，今后在修复手术时加以应用，将加速周围神经的恢复。本实验通过制作大鼠坐骨神经缺损模型，用神经再生室桥接缺损区域，构成神经再生室，将氯化镁溶液注入再生室中，通过光镜和电镜观察大鼠坐骨神经离断后，神经断端的微结构变化，验证氯化镁是否对周围神经损伤修复具有促进作用。

1材料与方法

1.1实验动物及分组将90只雄性SD大鼠(280～300 g，购于河北医科大学实验动物中心，动物合格证编号：1511010)，随机分为氯化镁组(MgCl2组)、神经生长因子组(NGF组)和0.9%氯化钠溶液组(NaCl组)，每组30只。

1.2方法以10%水合氯醛对其进行腹腔内注射麻醉，剂量3.5 ml/kg。制作1 cm坐骨神经缺损模型，分别以内径1.5 mm硅胶管桥接坐骨神经缺损，以9-0无创缝线做神经外膜固定，构成神经再生室。分别将1 mmol/L氯化镁(河北医科大学药理实验室配)、鼠神经生长因子(舒泰神北京药业有限公司生产)、0.9%氯化钠溶液注入神经再生室。分别于术后4、8、12周分批处死动物，取出再生室中神经组织，根据实验仪器要求不同，选用不同固定液固定后，观察神经断端局部微结构改变。

1.3观察指标

1.3.1光镜观察：分别在4、8、12周时，处死动物，取出神经再生室中神经组织，以4%多聚甲醛缓冲液中固定，脱水，石蜡包埋，60℃恒温置于LFB液中浸泡过夜，再次以乙醇梯度脱水、HE染色，蒸馏水洗涤，连续做4 μm切片，光镜下观察神经纤维及髓鞘的再生情况。3组再生神经组织中点连续切取5张切片,每张切片随机取5个面积相同视野作为测量对象, 使用自带图文分析系统计算再生神经纤维的数目及再生纤维截面积。

1.3.2电镜观察:同样取出神经再生室中再生神经组织，以2.5%戊二醛固定24 h后，磷酸缓冲液冲洗3次，1%锇酸固定，蒸馏水冲洗，乙醇梯度脱水，树脂包埋，做超薄切片后，透射电镜观察神经再生室中雪旺细胞的增殖和发育情况，髓鞘的超微结构。

2结果

2.1大体观察在4、8、12周各个时相，MgCl2组和NGF组的神经再生室中，神经再生形成条索均匀，直径较大。而对照组在各个时相新生的神经条索纤细。

2.2光镜观察术后4周，MgCl2组及NGF组再生神经纤维较少，稀疏。但分布均匀、髓鞘较厚，结缔组织较少。Nacl组神经纤维分布疏散，大小不均，髓鞘较薄。术后8周时MgCl2组及NGF组再生神经中有髓神经纤维均增多、增粗，髓鞘增厚，神经纤维分布较密集。术后12周，MgCl2组和NGF组神经纤维髓鞘肿胀消失，再生的神经纤维明显增多。 排列成束，轴突的直径和髓鞘的厚度接近正常。NaCl组损伤处远端神经神经纤维髓鞘仍有肿胀，成纤维细胞增多，神经纤维形成稀疏，直径较小。MgCl2组和NGF组术后4、8、12周再生神经纤维数目和再生神经纤维截面积高于NaCl组，差异有统计学意义(P<0.05)，而MgCl2组与NGF组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，图1～3。

表1　3组在术后不同时相再生纤维数目及再生神经截面积　±s

注：与NaCl组比较，*P<0.05

图1　3组术后不同时相再生纤维数目

2.3电镜观察治疗组新生神经纤维再生数量增多，雪旺氏细胞增生明显，形态接近正常。其髓鞘厚度均匀增加，鞘层分离不明显。 神经膜细胞及轴浆有轻度的变性，轴浆内可见微丝、微管和线粒体等细胞器，仍有少量残留的变性神经纤维， 其余的纤维组织结构正常。 对照组神经纤维再生不明显，髓鞘结构模糊，扭曲，雪旺氏细胞增生不明显，表型幼稚。见图4。

图2　3组术后不同时相再生纤维截面积

图3　3组术后不同时相神经断端再生光镜观察(×200)

图4　3组术后不同时相神经断端再生电镜观察(×1 200)

3讨论

周围神经损伤约占全身创伤的3%～10%[1]，致残率高达1/1 000[3]，治疗费用昂贵，给患者及其家属造成很大的经济负担。神经损伤的分类较多，Sunderland分类根据组织学损伤程度，分为以下5度：Ⅰ神经麻痹，轴索完整；Ⅱ神经内膜管完整，神经纤维可以再生；Ⅲ神经内膜损伤，神经移植效果不确切，形成神经瘤或者是神经束膜的误接；Ⅳ仅神经外膜完整，神经束膜也损伤。神经丛生，组织结构混乱，需要手术重建；Ⅴ神经断裂伤。根据不同的损伤形式，选择保守治疗、直接缝合或是神经移植治疗。但是在损伤后，神经局部发生继发的氧化应激及变性，神经周围微环境恶化，造成神经二次损伤。因此，对神经再生的研究热点集中在移植的材料和局部微环境的改善等方面。

在材料方面，大致分为自体神经、血管和筋膜以及各种神经导管。血管、肌腱、肌肉等自体材料的缺点：易于塌陷、形成瘢痕，供区的功能障碍[4]。与此相比，神经再生室能桥接神经断端，形成局部神经生长的微环境。用于构建神经再生室的材料种类繁多，各具特点。对于羊膜等可吸收及具有生物功能的再生室，其作用可能混淆再生室中所使用药物的作用。根据本次实验目的，神经断端的微环境需要相对封闭，构成神经再生室的材料通透性低，与外界体液交换较少。并且具有良好的生物相容性，可以抵抗周围肌肉的挤压。硅胶管具有无毒，安全，具有一定力学强度，通透性低的优点。早在1982年，硅胶管就应用于修复大鼠坐骨神经6 mm缺损[5]。本实验选取其构建神经再生室可以达到本次实验目的。

众所周知，神经损伤后，沿神经轴索的走行，髓鞘发生华勒氏变性。雪旺细胞释放，与巨噬细胞一起吞噬崩解的细胞碎片。继而形成新生雪旺细胞条带，称之为Bungner带。这条细胞带伴随断端新生轴突生长，逐渐替代损伤的间隙，完成神经的修复。神经损伤后，断端会分泌神经营养因子，包括神经生长因子，在断端的梯度浓度影响下，沿此方向生长，保证神经生长的方向一致。一般在伤后24 h，轴突开始再生，呈圆锥形沿基膜生长，逐渐生长至末梢器官，大约1 mm/d[6]。根据这个速度计算，所以我们选择4、8、12周作为观察的时相。

除了损伤神经断端的变性外，未损伤的神经也会发生变性的原因可能是在应激状态下，镁离子水平降低，钙离子通道大量开放，钙离子内流，引起细胞肿胀，凋亡。从而使得神经断端相邻节段的激发损伤，恢复困难。镁离子是维持细胞正常代谢的必需的离子之一，通过调节细胞内钾离子的浓度，从而维持细胞正常形态。同时对钙离子内流起到拮抗作用，避免钙离子大量内流造成的细胞毒性。文献报道，镁离子可以促进脑和脊髓损伤细胞的恢复[7]。但对外周神经研究的较少。本文旨在探讨氯化镁是否具有促进周围神经损伤的作用，为临床应用氯化镁促进神经恢复提供依据。

神经生长受神经营养物质的调控。神经生长因子是重要的神经营养物质。在鼠的周围神经损伤模型中NGF起到重要的作用[8]。其他的促神经轴突生长因子及基质，也有促进作用。神经生长因子是已应用于临床的神经营养药物，疗效肯定[9]。临床给药途径包括全身和局部。神经生长因子全身给药不能通过血脑屏障，副作用大。文献报道：NGF作用于轴突纤维的生长，而不是神经元本身[10]。所以，在局部应用药物促进神经生长是可行的。所以本实验选择神经生长因子作为对照，评价镁离子局部应用对神经再生微结构的影响。本文的实验结果显示：局部应用NGF和Mgcl2后，轴突细胞再生较对照组明显增多，表明氯化镁可促进神经轴突细胞的再生。

局部用药可以提高神经再生室中的药物浓度形成，直接浓度梯度，可以很快形成神经趋向性。但是，局部药物的浓度对神经细胞的生长也有不同的影响。查阅文献未发现神经再生室中可以应用多大浓度的镁离子。文献报道，如果镁离子浓度过高，镁离子对神经的保护作用反而降低[11]。其机制可能是镁离子的浓度过高对钙离子通道的抑制作用，使其对神经细胞的保护作用降低。鄢开胜等[12]对体外培养的螺旋神经节细胞预先给予1 mmol/L的MgCl2能增加暴露于谷氨酸的螺旋神经节细胞的存活率，还能抑制谷氨酸引起的螺旋神经节细胞内游离钙增加的效应，对螺旋神经节细胞损伤发挥保护作用。本实验光镜观察到在实验的各个时相，氯化镁组的神经纤维再生数目和轴突面积均远高于对照组，虽然不及神经生长因子组，但是差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明，局部应用1 mmol/L氯化镁，可以促进神经轴突的生长。

在对照组也发现了神经的再生现象。这可能是由于大鼠的神经再生能力强，神经再生室形成了神经再生的通道；虽然0.9%氯化钠溶液不具备促神经生长的作用，但是其流动形成了浓度梯度，间接促进了神经的再生[13]。

外周神经损伤后p38 MAPK活化，雪旺氏细胞去分化[14]，雪旺氏细胞衰老，同时导致成纤维细胞衰老。而实验表明：轴索再生受限与神经断端微环境中的衰老SCs增加有关[15]。本次实验电镜观察显示：氯化镁组和神经生长因子组的神经断端髓鞘和雪旺氏细胞增生明显，远远高于对照组。证明局部应用氯化镁和神经生长因子类似，可以促进神经纤维再生。实验同时观测到氯化镁组和神经生长因子组成纤维细胞增多类似，肉眼观察其形成神经束较完整。而对照组形成神经纤维较稀疏。成纤维细胞主要是修复断端创伤中断裂的组织，它的合成和降解，可使损伤部位形成有张力的组织。解释了大体观察所发现的氯化镁组及神经生长因子组神经纤维再生较好的现象。

通过本次实验，我们发现了局部应用氯化镁具有促神经轴突及雪旺氏细胞生长的作用，但机制尚不明确。我们将结合进一步体外细胞培养实验，进一步探索镁离子对神经细胞生长、分化的作用。

参考文献

1Noble J,Munro CA,Prasad VS,et al.Analysis of upper and lower extremity peripheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries.J Trauma,1998,45:116-122.

2Taylor CA,Braza D,Rice JB,et al.The incidence of peripheral nerve injury in extremity trauma.Am J Phys Med Rehabil,2008,87:381-385.

3Daly W,Yao L,Zeugolis D,et al.A biomaterials approach to peripheral nerve regeneration: bridging the peripheral nerve gap and enhancing functional recovery.J R Soc Interface,2012,9:202-221.

4Firat C,Geyik Y,Aytekin AH,et al.Comparison of nerve, vessel, and cartilage grafts in promoting peripheral nerve regeneration. Ann Plast Surg,2014,73:54-61.

5Lundborg G,Gelberman RH,Longo FM,et al.In vivo regeneration of cut nerves encased in silicone tubes: growth across a six-millimeter gap. J Neuropathol Exp Neurol,1982,41:412-22.

6Mohler LR, Hanel DP. Closed fractures complicated by peripheral nerve injury. J Am Acad Orthop Surg,2006,14:32-37.

7Lee JH, Roy J, Sohn HM, et al. Magnesium in a polyethylene glycol formulation provides neuroprotection after unilateral cervical spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976),2010,35:2041-2048.

8Machalinski B,Lazewski-Banaszak P,Dabkowska E,et al.The role of neurotrophic factors in regeneration of the nervous system.Neurol Neurochir Pol,2012,46: 579-590.

9Yu H,Liu J,Ma J,et al.Local delivery of controlled released nerve growth factor promotes sciatic nerve regeneration after crush injury. Neurosci Lett,2014,566:177-181.

10Kumamoto J,Kitahata H,Goto M,et al.Effects of medium flow on axon growth with or without nerve growth factor. Biochem Biophys Res Commun,2015,465:26-29.

11Konrad M, Weber S.Recent advances in molecular genetics of hereditary magnesium-losing disorders. J Am Soc Nephrol,2003,14:249-260.

12鄢开胜, 薛秋红, 张佳华,等. 镁离子对谷氨酸诱发的螺旋神经节细胞损伤的保护作用. 中华医学杂志,2006:1572-1574.

13Kumamoto J,Kitahata H,Goto M,et al.Effects of medium flow on axon growth with or without nerve growth factor. Biochem Biophys Res Commun,2015,465:26-29.

14Yang DP, Kim J, Syed N, et al. p38 MAPK activation promotes denervated Schwann cell phenotype and functions as a negative regulator of Schwann cell differentiation and myelination. J Neurosci,2012,32:7158-7168.

15Saheb-Al-Zamani M, Yan Y, Farber SJ, et al. Limited regeneration in long acellular nerve allografts is associated with increased Schwann cell senescence. Exp Neurol,2013,247:165-177.

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.14.001

通讯作者：马维，050000石家庄市，河北医科大学第二医院骨科；

【中图分类号】R 424

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)14-2085-04

(收稿日期：2016-02-03)

A experimental study on the effects of magnesium chloride on ultrastructure renovation after sciatic nerve injury in rats

LIMing,SONGYongzhou,CAOShuxing,etal.

DepartmentofOrthopedics,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of magnesium chloride on ultrastructure renovation after sciatic nerve injury in rats .MethodsNinety SD rats were randomly divided into 3 groups: magnesium chloride group (MgCl2 group), nerve growth factor group (NGF group), 0.9% sodium chloride group (NaCl group), with 30 rats in each group.Firstly,the animal models with sciatic nerve injury were established,and the injury was bridged with silicone tube to set up a nerve regeneration chamber (NRC),then 1mmol/L MgCl2,NCF,0.9% sodium chloride solution was infused into the chamber,respectively. After operation the rats were sacrificed on 4,8,12 weeks,respectively. The regenerating tissues in NRC were taken out to be fixed,finally, the regenerating nerve fibers number and section area of regenerating nerve fibers were observed under light microscope,moreover, the state of proliferation and development of Schwann cells in NRC and ultrastructure of medulla sheath was observed by electron microscopy.ResultsThe regenerating nerve fibers number and section area of regenerating nerve fibers in MgCl2 group and NGF group on 4,8,12 weeks were significantly higher than those in Nacl group (P<0.05). However there were no significant differences between MgCl2 group and NGF group (P>0.05). In MgCl2 group and NGF group,the regenerating nerve fibers number was increased,the proliferation of Schwann cells was obvious and cell's shape was nearly normal,the thickness of medulla sheath was uniformly increased. in contrast to that, in NaCl group, nerve fibers regeneration was not obvious, medulla sheath structures were blurred and twisted, the proliferation of Schwann cells was not obvious, with immature phenotype.ConclusionMagnesium chloride can promote the ultrastructure renovation after sciatic nerve injury in rats.

【Key words】magnesium chloride; Schwann cell;nerve growth factor; sciatic nerve injury

项目来源：河北省医学科学研究重点课题(编号：ZL20140291)

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