藜致病真菌的鉴定及其生物学特性研究

于文莹，姜述君，卜志新，马婧，杨系玲，范文艳

（黑龙江八一农垦大学农学院，大庆163319）

藜致病真菌的鉴定及其生物学特性研究

于文莹，姜述君，卜志新，马婧，杨系玲，范文艳

（黑龙江八一农垦大学农学院，大庆163319）

从野外自然患病的藜植株上分离一高致病菌株（Hf-05），经人工接种试验证实为侵染藜的病原菌。菌株形态学和ITS序列分析结果表明，菌株Hf-05为玉蜀黍赤霉菌的变种。生物学特性研究结果表明，Hf-05的最适C源为麦芽糖，在麦芽糖中最易产孢，最适N源为硝酸钠；pH为8时生长速度最快，孢子萌发率最高；25℃是菌丝生长最适宜的温度；孢子萌发的最适宜温度为30℃；黑暗条件更有利于该菌株生长。

藜；致病菌；ITS序列；生物学特性

藜（Chenopodium album L.）为藜科（Chenopodiaceae）藜属（Chenopodium）植物，又称为灰菜、灰条菜、落藜，其为一年生草本植物，种子繁殖，全国各地均有分布，是世界恶性杂草，常形成单一种群或与萹蓄、马唐等混生［1］。藜主要为害麦类、棉花、豆类、薯类、花生、蔬菜、玉米和果树等，同时也是地老虎、棉铃虫和双斑萤叶甲的寄主［2］，有时也是棉蚜的寄主［3］。藜的生命力极其旺盛，其地下根系对作物生长危害甚大，特别是在作物苗期，若不防治将严重影响作物的产量。藜生长常高出作物，影响作物的光合作用，干扰作物生长［4］。目前，对于旱田恶性杂草藜的防除主要采用的是化学防治。化学除草剂得到了推广和应用，虽然显著的提高农业生产的经济效益，同时也带来了残留毒性高、难降解、破坏生态平衡、抗药性杂草的出现等一系列问题，而生物防治是上述问题的一个有效途径［5-6］。

目前，关于恶性杂草藜的生物防治研究较少，已报道的藜生防菌仅有链格孢和壳二孢菌［7-10］。菌株Hf-05是作者所在实验室获得了一株对恶性杂草藜具有强致病力的菌株。研究利用ITS序列分析技术对菌株Hf-05进行了鉴定，并初步研究了菌株生物学特性，为进一步研究应用菌株Hf-05防治恶性杂草藜提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

试验采用从藜植株上分离纯化后低温保存的藜的致病菌株，该菌株保存于黑龙江八一农垦大学植物保护实验室。实验中使用的培养基主要有PDA培养基和Czapek培养基。

1.2 主要实验仪器及试剂

超净工作台、高压灭菌锅、微波炉、电磁炉、培养箱、生物显微镜、冰箱、天平、pH自动检测仪、血球计数板、研钵、1.5 mL离心管、2 mL离心管、水浴锅、冰盒、低温离心机、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、PCR管、移液枪等。

待用菌丝、液氮、CTAB提取液、酚：氯仿：异戊醇、醋酸钠、无水乙醇、异丙醇、TAE、琼脂糖、EB替代物、ddH2O、R-Taq酶、引物、dNTP、PCR Buffer、Marker、Loading Buffer、胶回收试剂盒。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的形态学鉴定

将菌株在PDA培养基上培养后在显微镜下观察其菌落、菌丝及孢子的形态特征，根据《真菌鉴定手册》及《中国气传真菌彩色图谱》进行分类鉴定［11-12］。

1.3.2 菌株的分子生物学鉴定

将纯化培养好的生防菌株置于铺有玻璃纸的PDA培养基上培养，4天后，在无菌条件下，取下玻璃纸，置于干燥无菌的灭菌箱中，晾干后，放在无菌锡箔纸上，包好做好标记，-20℃冰箱中保存待用，为下一步用菌丝提取DNA做准备，每个菌株三次重复。

快速提取DNA：将菌丝，在-80℃冷冻过夜，然后冷冻干燥出去水分；将干燥后的菌丝用液氮研磨后迅速转入离心管内；加入预热30 min（65℃）的CTAB提取液600 μL，65℃水浴60 min，每隔10 min摇匀一次；向离心管内加入500 μL酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）剧烈转抽10 min，4℃12 000 rpm离心10 min；取上清液加入10%醋酸铵和两倍体积的无水乙醇，混匀后冰浴20 min；4℃12 000 rpm离心20 min；弃上清，70%乙醇洗涤，二次乙醇沉淀，待沉淀风干后，加入50 μL水溶液，用于PCR反应。

引物的设计：通用引物ITS（ITS1正向：5′-CTTG-GTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；ITS4反向：5′-TCCTC-CGCTTATTGATATGC-3′）；

PCR扩增：PCR反应体系为25 μL，包括：dNTP混合溶液0.5 μL、10 mmol·L-1上下游引物各0.5 μL、10×PCR buffer2.5 μL、Tap DNA聚合酶0.5 μL、模板DNA1.0 μL、ddH2O 19.5 μL。

PCR程序如下：94℃下预变性5 min；94℃下变性50 S、54℃下退火50 S、72℃下延伸50 S，30个循环；最后72℃下延伸10 min。扩增产物经电泳检测后，回收、纯化PCR产物，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DHSa菌株，筛选阳性克隆，送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行序列测定。通过BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.Gov/）对测序结果进行分析，选择相似性较高的菌株序列与供试的菌株序列，用DNAMAN4.0软件进行多序列比对，用MEGA5.0软件构建系统进化树。

1.3.3 菌株对藜的致病力检测

选取长势整齐一致的藜植株，每株取大小相差不多的叶片分别置于培养皿中。培养皿底部先铺一层无菌滤纸，滤纸用无菌水浸湿，以起到保湿作用。离体的藜叶片用75%的酒精进行表面消毒处理，再用无菌水冲洗干净，叶片背面向上平铺在培养皿内的滤纸上，每个培养皿中放置6枚叶片。将分离纯化后得到的菌种进行活化培养，在生长旺盛的部位取直径为7 mm的Hf-05菌碟放在离体的藜叶片背面，以未接种处理为对照。48 h后开始观察记录叶片是否发病以及病斑大小等情况。

1.3.4 C、N源对菌株生长的影响

以Czapek培养基为基础，选取葡萄糖、蔗糖、淀粉、麦芽糖作为培养基C源，硫酸铵、硝酸钠、尿素、蛋白胨作为N源分别替换原有培养基中的C、N源培养菌株，观察菌株生长情况，测量菌落大小。

在Czapek培养基中，固定N源（硝酸钠），分别以不同C源的培养基在25℃条件下培养病原菌株，每种处理4个重复，每隔24 h测量1次菌落直径，测量采用垂直十字交叉法，并观察菌株是否产孢；以同样方法，固定C源（蔗糖），分别以不同N源进行培养，每种处理4个重复，每隔24 h测量1次菌落直径，观察菌株是否产孢。

1.3.5 pH值对菌株生长的影响

以Czapek培养基为基础，用HCl和NaOH调节培养基的pH值，用pH自动检测仪测定。共设置8个酸碱度处理，pH值分别为4、5、6、7、8、9、10和11。接菌处理后置于25℃培养箱内培养，观察菌株生长情况并测量菌落大小，以确定pH值对病原菌株生长的影响。

1.3.6 培养温度对菌株生长的影响

将直径8 mm的菌碟接种至PDA培养基平板上，培养基的pH为6.5。接种后将培养皿分别置于10、15、20、25、30、35℃的环境中培养，观察菌株生长情况，每24 h测量菌落大小，每个处理4次重复，以确定菌株生长的最适温度。

1.3.7 光照对病原菌株生长的影响

将病原菌接种于pH为6.5的PDA平板上，置于25℃光照培养箱中进行培养。光照条件分别设置为全暗、全光照（20 W日光灯距培养物10 cm）和12 h光照/12 h黑暗。培养5天后观察菌株生长情况，分别测量菌落大小进行比较，每个处理4次重复。

1.3.8 病原菌株的孢子萌发

采用孢子悬滴法测定孢子萌发情况［13］。无菌培养皿中放3张灭菌后滤纸，倒入无菌水，皿内放入牛津杯两个，并将凹玻片架在其上，凹玻片凹形周围涂无菌凡士林，后用接菌环蘸取孢子悬浮液于盖玻片上，翻转扣在凹玻片上，盖上皿盖，然后置于25℃光照培养箱中培养，光照和黑暗交替各12 h，孢子悬浮液pH分别设置为4、5、6、7、8、9、10、11，在光学显微镜下观察孢子的萌发过程，并计算孢子萌发率。温度试验与光照试验中孢子悬浮液的pH均为7。

将操作方法如上的玻片置于光照培养箱中，分别置于15、20、25、30、和35℃下培养，培养液pH为7.5。48 h后观察孢子的萌发情况，统计孢子萌发率。试验重复4次，每次重复观察不少于200个孢子。

将操作方法如上的玻片置于25℃光照培养箱中培养，分设全暗培养、全光照培养、12 h光照·12 h-1黑暗培养，48 h后观察孢子萌发情况，计算孢子萌发率。

1.4 数据处理

试验数据用SPSS 19.0和Microsoft Excel 2010进行统计分析和处理。

2 结果分析

2.1 菌株的形态学鉴定

菌株Hf-05的菌丝呈白色棉絮状，菌丝有横隔，分枝。培养基上有淡紫色色素产生（图1）；分生孢子呈镰刀形，有隔膜2～7个，分隔明显，大小为（3～6）μm×（25～72）μm，基部有明显的足胞（图2）。Hf-05的形态特征符合镰孢菌属（Fusarum spp.）的形态特征。

图1 H f-05菌株菌落形态Fig.1 Morphology of colony of strain Hf-05

图2 H f-05菌株分生孢子形态Fig.2 Morphology of spore of strain Hf-05

2.2 菌株的分子生物学鉴定

Hf-05菌株PCR扩增及序列测定后，在NCBI中进行ITS序列比对后，与多个镰孢菌的序列相似比达99%。由系统发育树中也可以看出，Hf-05与Gibberella zeae strain GZ2在同一分支上，进化关系最为相近（图3）。由于菌株Hf-05与小麦赤霉病的遗传距离值大于66，但小于95，因此，确定菌株Hf-05为玉蜀黍赤霉菌的一个变种。

2.3 菌株对藜的致病力检测

如图4所示，试验处理的所有叶片（除对照外）均出现病斑，且病斑上带有白色霉层，病斑面积占叶片总面积的13.8%。

图3 菌株H f-05与相关菌株的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain Hf-05 and its relatives

图4 菌株H f-05的致病力检测Fig.4 Pathogenicity test of strain Hf-05

2.4 碳、氮源对菌株生长的影响

从图5可以看出，在碳源筛选方面，Hf-05对麦芽糖的利用效果最好，其次是淀粉与蔗糖，葡萄糖的效果最差，但相差并不十分明显，可见这几种糖类均可较好的为Hf-05提供碳源；且Hf-05在麦芽糖培养基上最易产孢，产孢量最大。

从图6可以看出，在氮源筛选方面，Hf-05对硝酸钠的利用效果最好，菌落在含硝酸钠的培养基上生长最快，在硫酸铵的培养基上生长最差。

2.5 pH值对菌株生长和孢子萌发的影响

从图7可以看出，Hf-05在pH值为4～11的培养基上均可生长，适宜生长的酸碱度为pH7～8，最适酸碱度为pH8。试验结果表明，Hf-05适宜在中性偏碱性条件下生长，在极酸或极碱条件下菌丝生长都较为缓慢。从图8可以看出，Hf-05在pH4～11的条件下孢子均可萌发，最适萌发酸碱度为pH8时，48 h的孢子萌发率为94.25%。

图5 碳源对菌株H f-05生长的影响Fig.5 Effects of C sources on strain Hf-05 growth

图6 氮源对菌株Hf-05生长的影响Fig.6 Effects of N sources on strain Hf-05 growth

图7 pH对菌株H f-05生长的影响Fig.7 Effect of pH on the growth of strain Hf-05

图8 pH对菌株H f-05孢子萌发的影响Fig.8 Effect of pH on conidia germination of strain Hf-05

2.6 培养温度对菌株生长和孢子萌发的影响

从图9可以看出，Hf-05适宜生长温度为20～30℃，最适温度为25℃，高于35℃菌株不生长，在低温条件下生长极为缓慢；从图10可以看出，Hf-05的适宜孢子萌发温度为20～30℃，在10℃或35℃时萌发率极低，最适萌发温度为30℃，孢子萌发率为93.5%。

图9 温度对菌株H f-05生长的影响Fig.9 Effect of temperature on the growth of strain Hf-05

图10 温度对菌株H f-05孢子萌发的影响Fig.10 Effect of temperature on conidia germination of strain Hf-05

2.7 光照对菌株生长和孢子萌发的影响

从表1可以看出，Hf-05在12 h光照/12 h黑暗与24 h光照菌丝生长速率差异不显著；24 h黑暗条件下菌丝生长最快，且与其他光照条件差异显著，表明Hf-05更适合在黑暗条件下培养。不同光照条件对Hf-05的孢子萌发影响不明显，3种光照条件下孢子萌发率都在93%左右，且差异不显著。

表1 光照对菌株H f-05菌丝生长和孢子萌发的影响Table1 Effect of light on hypha growth and conidia germination of strain Hf-05

3 结论

试验从野外自然患病的藜植株上分离筛选得到的藜致病菌株Hf-05，基于菌株形态学特征、ITS序列分析及其系统发育树鉴定，确定菌株Hf-05为玉蜀黍赤霉菌的变种。

菌株生物学特性的研究结果表明，菌株Hf-05的最适C源为麦芽糖，且在麦芽糖中最易产孢，最适N源为硝酸钠。菌株在pH8时生长速度最快，孢子萌发率最高。孢子萌发的最适宜温度为30℃，25℃是菌丝生长最适宜的温度。黑暗条件更有利于菌株Hf-05生长，孢子萌发对光照条件要求不高。

4 讨论

镰孢菌属包括很多的种类，并且该属真菌在形态、致病力和培养特性等方面存在较大的异质性，从而导致该属真菌的分类鉴定较为困难，因此，利用分子生物学方法对菌株进行鉴定是十分必要的。内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）具有极高的保守性，并且种内相对一致，而种间差异明显，这一特征使得ITS非常适合于真菌分子鉴定。一些研究表明，利用ITS鉴定技术能有效地区分镰孢菌属真菌［14-16］，研究的ITS鉴定结果表明，菌株Hf-05的ITS序列与GenBank数据库中镰孢菌属ITS序列的高同源性达到99%。系统发育关系分析结果表明，菌株Hf-05与玉蜀黍赤霉菌菌株Gibberella zeae strain GZ2进化关系最近，但两个菌株的遗传距离值介于66～95之间，表明这两个菌之间存在明显差异，这一结果说明，菌株Hf-05与玉蜀黍赤霉菌菌株Gibberella zeae strain GZ2为玉蜀黍赤霉菌的不同变种。由于GenBank中镰孢菌属ITS序列有限，因此，研究还无法确定菌株Hf-05属于玉蜀黍赤霉菌的那一类变种。

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Identification and Biological Characteristics of Pathogenic Fungus in Chenopodium album L.

Yu W enying，Jiang Shujun，Bu Zhixin，M a Jing，Yang Xiling，Fan W enyan
（College of Agronomy，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Apathogenic strain Hf-05 was isolated from the diseased goosefoots（Chenopodium album L）plant in the field.Artifical infection proved that the strain was a pathogen to goosefoots.The strain was identified as variety of Gibberella zeae by method of morphology and ITS sequence.The biological characteristics experiment results showed that the optimum carbon source of strain Hf-05 was maltose.It was easily for Hf-05 to produce spores in maltose.The optimum nitrogen source of Hf-05 was sodium nitrate.The strain Hf-05 had a fastest growth rates and highest spore germination rates under pH 8.The most suitable growth temperature of Hf-05 was 25℃.The optimum temperature of spore germination was 30℃.Dark condition was more conducive to the strain Hf-05 growth.

Chenopodium album L.；pathogenic fungus；ITS sequence；biological characteristics

S476

A

1002-2090（2016）03-0006-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.002

2015-03-16

黑龙江省农垦总局科技攻关项目（HNK125B-08-05A）。

于文莹（1988-），女，黑龙江八一农垦大学农学院2012级硕士研究生。

范文艳，女，教授，博士研究生导师，E-mail：fwyjsj@sohu.com。