室旁核中血管紧张素Ⅱ通过活性氧介导慢性间歇性低氧大鼠的升压作用

唐志强，范一菲，汪金丽，程文慧，沈 兵，钟明奎

室旁核中血管紧张素Ⅱ通过活性氧介导慢性间歇性低氧大鼠的升压作用

唐志强，范一菲，汪金丽，程文慧，沈 兵，钟明奎

目的 研究室旁核（PVN）中血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）-活性氧（ROS）通路在慢性间歇性低氧（CIH）大鼠的升压作用。方法 将雄性SD大鼠随机分为对照组和慢性间歇性低氧组（CIH组）（8h/d，连续15d）。用立体定位仪进行PVN核团定位微量注射，采用颈动脉插管法在体测量大鼠平均动脉压（MAP），ELISA法测量PVN中AngⅡ、ROS含量，Westernblot法测定PVN中血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）的蛋白表达，应用试剂盒（羟胺法）测定PVN中的总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力。结果 与对照组比较，CIH组大鼠PVN中ROS（P＜0.05）和AngⅡ含量显著升高（P＜0.01），AT1R的表达显著增加（P＜0.05），而T-SOD活力则明显下降（P＜0.01）。双侧PVN内微量注射AngⅡ（0.3 nmol）可升高两组大鼠的MAP，而CIH大鼠MAP升高更显著（P＜0.01）；超氧阴离子清除剂Tempol 可降低两组大鼠的MAP，而CIH大鼠 MAP降低更显著（P＜0.01）；Tempol预处理可抑制AngⅡ对两组大鼠的升压作用，且在CIH组中抑制作用更加明显（P＜0.01）。结论 室旁核中ROS介导了AngⅡ在CIH大鼠中的升压作用。

室旁核；活性氧；血管紧张素Ⅱ；慢性间歇性低氧；高血压

网络出版时间：2016-3-88：29：01 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.006.html

2015-12-21接收

睡眠呼吸暂停综合症（sleepapneasyndrome，SAS）与高血压有密切的联系，SAS会增加患中风、心衰等一些高血压相关疾病的风险［1］。SAS因为慢性间歇性低氧（chronicintermittenthypoxia，CIH）从而导致了交感神经的兴奋，内皮功能的紊乱以及血管的炎症［2］，因此CIH被认为是引起高血压最重要的因素。交感神经活动的过度增强是各种高血压的重要特征之一。研究［3］显示，CIH引起高血压的发病机制与持续增强的交感神经兴奋有关。下丘脑室旁核（paraventricularnucleus，PVN）是整合心血管活动的重要核团，其下行纤维投射到延髓头端腹外侧区和脊髓中间外侧柱控制着交感结前神经元，因此其功能异常可能是导致 CIH时交感神经活动增强的重要原因。研究［4-5］表明中枢活性氧（reactive oxygen species，ROS）及某些气体信号分子与高血压时交感神经活动的增强密切相关，脑内血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）作为调节交感神经活动和动脉血压的重要神经递质，与高血压的发生也有着密切的关系。研究［6］表明，中枢ROS介导了AngⅡ引起的心交感传入反射增强、肾交感神经放电增加等作用。该研究旨在探讨在CIH大鼠中，下丘脑PVN中ROS介导的AngⅡ的升血压效应及其机制，为防治SAS引起的高血压提供科学实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性健康SD大鼠，190～230 g，清洁级，由安徽医科大学实验动物中心提供。大鼠分笼饲养，饮水、摄食自由，通风良好，室温（20±5）℃。

1.2 仪器 间歇性低氧舱（CYS-1型，南京新飞分析仪器制造有限公司）；PowerLab 8/30数据采集分析处理系统（澳大利亚ADInstrument公司）；酶标仪（美国Themo scientific公司）；单臂数字式立体定位仪、颅骨钻（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；医用压缩氧气（浓度＞99.9%）、压缩氮气（浓度＞99.99%）由合肥众益化工产品有限公司充装。

1.3 试剂 4-羟基-2，2，6，6-四甲基氧基哌啶（Tempol）、AngⅡ购自美国Sigma公司；兔抗血管紧张素Ⅱ 1型受体（angiotensinⅡ type 1 receptor，AT1R）、鼠抗β-actin购自美国Santa Cruz公司；Ang ⅡELISA检测试剂盒购自美国RD公司；总超氧化物歧化酶（total-superoxide dismutase，T-SOD）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4 模型的制作 大鼠适应环境饲养1周后进行实验，随机分为对照组（n=6）和CIH组（n=6），对照组除不充入氮气和氧气外，其余均与CIH组做相同处理。通过充入氮气稀释氧浓度的原理，CIH组放入间歇性低氧舱中，校准舱内的氧气浓度至环境浓度即21%，随后关闭舱门，在低氧舱内循环充入氮气和氧气，保证一个循环充氮4 min后充氧5 min，在此期间用氧探头监测舱内氧气浓度，调节充气流量使每一个循环中舱内最低氧气浓度达到6%，并持续约45 s，然后充入氧气使氧浓度逐渐恢复至21%，舱内氮气与氧气的切换通过定时电路程序控制，实验每天早上9时开始，重复约8 h，连续15 d。

1.5 在体血流动力学指标检测 腹腔注射麻醉剂乌拉坦（800 mg/kg）和α-氯醛糖（40 mg/kg）混合麻醉，仰卧位固定大鼠，依次进行气管、左颈外静脉、左颈总动脉插管手术。左颈外静脉与注入混合麻醉溶液的灭菌注射器连接，方便实验中及时补充麻醉药量；压力换能器与左颈总动脉通过充有肝素钠生理盐水溶液的聚乙烯管相连，并连接powerlab 8/30数据采集分析处理系统，实时记录动脉血压、平均动脉压（mean arterial blood pressure，MAP）。药物对MAP的改变水平以注射药物前后实测值之差表示，ΔMAP=注射后MAP-注射前MAP。

1.6 PVN立体定位及微量注射 将麻醉后大鼠头部俯卧位固定在立体定位仪上，沿矢状中线切开头皮，暴露前囟，根据Paxinos和Watson的大鼠脑立体定位图谱进行定位，双侧PVN具体位置为：前囟后1.8 mm，中线旁开0.4 mm，背侧面深7.9 mm，定位后运用颅骨钻钻孔，插入内径为0.3 mm的插管。采用微量进样器沿插管位置双侧注射药物体积均为50 nl。生理盐水（normal saline，NS）+AngⅡ大鼠和Tempol+AngⅡ大鼠中AngⅡ均在前一药物注射5 min后注射。在所有药物注射完成后再沿插管位置注射50 nl的2%伊文斯蓝溶液对注射部位染色，左颈外静脉推入过量麻醉剂处死大鼠，迅速断头取脑，脑组织用10%福尔马林溶液固定，通过切片鉴定注射位点是否正确，如经鉴定注射位点不在PVN区域内的数据则不进行统计处理。

1.7 PVN组织标本的制备 大鼠过量麻醉后迅速断头取脑，立即置于液氮中冷冻固定，用冰冻切片机做大脑冠状切片，根据大鼠脑立体定位图谱确定PVN位置，用刀片垂直切取约2 mm厚脑片，再使用内径为1.5 mm的针头，用打孔法在脑片上取出PVN区，称重后置EP管中，-80℃保存备用。

1.8 Western blot法检测PVN中AT1R 取适量RIPA裂解液与PVN组织标本在玻璃匀浆器中研磨，匀浆成均一体系后离心（4℃、3 000 r/min离心20 min），取上清液。采用SDS-PAGE电泳分离蛋白。电泳（浓缩胶：60 V、30 min；分离胶：120 V、1.5 h）；转膜（150 mA、2 h），一抗（4℃、过夜）：兔抗AT1R（1∶350）、鼠抗β-actin（1∶1 000），二抗（常温摇床、2 h）：辣根过氧化物酶标记的羊抗兔（1∶20 000）、羊抗鼠（1∶40 000）。采用化学发光底物显影。使用Quantity One软件分析各蛋白条带的灰度值，通过与内参β-actin的比值，分析AT1R的蛋白相对表达水平。

1.9 ELISA试剂盒测定PVN中AngⅡ及ROS含量 取适量NS与PVN组织标本在玻璃匀浆器中研磨，匀浆成均一体系后离心（4℃、3 000 r/min离心10 min），取上清液。在预先包被有抗体的微孔中，依次加入标准品、待测样品、辣根过氧化物酶标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤，用底物TMB显色，用酶标仪在450 nm波长下测定光密度（optical density，OD）值，绘制标准曲线，根据公式计算样品浓度。

1.10 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行分析，数据以±s表示。两组均数间的比较采用t检验。

2 结果

2.1 CIH对大鼠PVN中AngⅡ含量及AT1R蛋白表达的影响 与对照组比较，ELISA法检测结果显示，CIH组大鼠PVN中AngⅡ含量［（186.599± 9.329）pg/mgprot vs（246.650±7.031）pg/mgprot，t =-5.141，P＜0.01］显著升高；Western blot法显示AT1R蛋白表达［（0.729±0.090）vs（1.020± 0.065），t=-2.608，P＜0.05］显著增加。见图1。

2.2 CIH对大鼠PVN中 ROS含量及T-SOD活力的影响 ELISA法检测结果显示，与对照组比较，CIH组大鼠PVN中ROS含量显著升高［（196.848 ±8.151）U/mgprot vs（242.538±16.086）U/mgprot，t=-2.534，P＜0.05］。T-SOD活力检测结果显示，与对照组比较，CIH组大鼠PVN中总SOD活力明显下降［（125.081±2.612）U/mgprot vs （95.204±4.269）U/mgprot，t=5.970，P＜0.01］。

2.3 PVN内微量注射Tem pol对AngⅡ升压作用的影响 双侧PVN内微量注射AngⅡ（0.3 nmol）两组大鼠的MAP皆升高，与对照组比较，CIH大鼠MAP升高更显著［（1.489±0.152）kPa vs（2.400± 0.298）kPa，t=-2.724，P＜0.05］；超氧阴离子清除剂Tempol两组大鼠对MAP皆降低，而CIH大鼠MAP降低更显著［（-0.333±0.046）kPa vs（-1.556±0.250）kPa，t=4.813，P＜0.01］；用Tempol对两组大鼠预处理，可抑制 AngⅡ的升压作用［NS +AngⅡ vs Tempol+AngⅡ，对照组：（1.444± 0.080）kPa vs（0.800±0.077）kPa，t=5.800，P＜0.01；CIH组：（2.222±0.174）kPa vs（0.778± 0.121）kPa，t=6.799，P＜0.01］。见图2。

图1 CIH对大鼠　PVN中　AngⅡ含量及AT1R蛋白表达的影响A：ELISA法检测各组　PVN中　AngⅡ含量；B：Western blot法检测各组PVN中　AT1R蛋白表达；与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

图2 PVN中分别微量注射　NS、AngⅡ、Tempol对大鼠血压的影响与同组NS比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与同组 NS+AngⅡ比较：##P＜0.01；与对照组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01

3 讨论

睡眠呼吸暂停是神经源性和难治性高血压的主要原因之一。CIH是睡眠呼吸暂停最重要的病理生理学特征及引起机体各器官损伤的主要机制，CIH引起高血压的具体机制还不十分清楚，但交感神经系统过度激活在高血压的发生、发展中起了重要的作用［3，7］。CIH时，反复刺激颈动脉体化学感受器，使其敏感性增加，从而诱导交感神经活动的过度增强。PVN是调节交感神经活动和动脉血压的重要中枢结构之一，通过与化学感受性反射中枢（孤束核和延髓腹侧面头端）的纤维联系对化学感受性反射进行调节。研究［8］显示，与对照组大鼠比较，注射γ-氨基丁酸A型受体激动剂抑制PVN神经元活动，引起CIH大鼠血压和交感神经活动下降更为显著。CIH大鼠，PVN内血管升压素能神经元释放血管升压素，通过V1a受体作用于延髓腹外侧头端引起交感神经活动增强［9］。光遗传学和逆行示踪技术显示，在CIH/高CO2暴露大鼠，PVN投射到脑干副交感核的兴奋性通路被抑制，使心迷走神经活动减弱［10］。这些研究［9-10］显示，PVN在CIH时交感神经活动过度增强中起着重要作用。

肾素-血管紧张素系统在CIH时被激活，Ang II通过外周和中枢途径升高血压，系统或中枢应用AT1受体阻断剂氯沙坦可抑制CIH引起的高血压［11-12］。本研究表明，CIH大鼠PVN内AngⅡ水平及AT1受体表达显著增加；双侧PVN内微量注射AngⅡ使对照组和CIH组大鼠的MAP皆升高，不过CIH大鼠MAP升高更为显著。长期应用γ-氨基丁酸A型受体激动剂可抑制PVN神经元活动或AT1的受体阻断剂可显著抑制CIH大鼠血压的升高［13］。这些结果表明，室旁核中AngⅡ及AT1R功能上调在CIH诱发大鼠高血压中起重要作用。

CIH类似于缺血和再灌注损伤作用，导致氧化应激和ROS产生增多，与高血压的产生密切相关［14］，在中枢 ROS可作为第二信使介导AngⅡ引起的交感兴奋和升压作用［15］。本实验向PVN内注射一种可以透过细胞膜的SOD类似物Tempol，可降低对照组和CIH组大鼠的动脉血压，CIH大鼠降低更显著；并且用Tempol预处理可抑制AngⅡ对两组大鼠的升压作用，而且在CIH组中的抑制作用更加明显；CIH大鼠PVN中总SOD活性检测显著降低。提示PVN中ROS介导了AngⅡ在CIH大鼠中的升压作用。AngⅡ引起ROS增加可能与参与ROS代谢的酶的活性变化有关。产生ROS系统包括NAD （P）H氧化酶、黄嘌呤氧化酶、线粒体链和非耦合的一氧化氮合酶等，其中NAD（P）H氧化酶是高血压病时引起ROS增多的关键酶。PVN中ROS升高可能与NAD（P）H氧化酶活性增加而SOD活性降低有关，即产生ROS的能力增加和（或）清除ROS的能力下降引起了ROS的增多。

PVN中AngⅡ-ROS信号通路在CIH引起交感神经活动过度激活及高血压的具体机制还不清楚。可能的推测是：CIH引起RAS激活，中枢的AngⅡ和PVN内AT1受体结合，通过PKC/c-Src途径激活NAD（P）H氧化酶产生ROS。一方面，ROS改变细胞膜对Ca2+或K+通透性使PVN神经元兴奋，或通过p38 MAPK途径促进PVN投射到延髓腹外侧头端的神经纤维末梢释放兴奋性递质谷氨酸，引起交感神经兴奋和血压升高；另一方面，ROS经ERK信号途径调节转录因子NF-κB、AP-1或HIF的活性，使AngⅡ、AT1受体、NAD（P）H氧化酶表达上调，SOD表达下调，引起血压长期增加［15］。

综上所述，PVN中AngⅡ-ROS通路在CIH引起高血压中起着及其重要的作用，PVN中AngⅡ、ROS及其相关的酶或受体可能成为治疗CIH诱发的高血压的潜在靶点。

［1］ Floras J S.Hypertension and Sleep Apnea［J］.Can JCardiol，2015，31（7）：889-97.

［2］ Silva A Q，Schreihofer A M.Altered sympathetic reflexes and vascular reactivity in rats after exposure to chronic intermittenthypoxia ［J］.JPhysiol，2011，15，589（Pt 6）：1463-76.

［3］ 李 艳，钟明奎，邹 坤，等.慢性间歇性低氧对大鼠血压和交感神经活动的影响［J］.中国老年学杂志，2012，32（23）：5162-4.

［4］ Sun H J，Zhou H，Feng XM，etal.Superoxide anions in the paraventricular nucleusmediate cardiac sympathetic afferent reflex in insulin resistance rats［J］.Acta Physiol（Oxf），2014，212（4）：267-82.

［5］ 邹 坤，李 艳，王烈成，等.室旁核中活性氧在高血压大鼠交感神经活动过度增强中的作用［J］.安徽医科大学学报，2012，47（7）：753-7.

［6］ Braga V A，Medeiros IA，Ribeiro T P，etal.Angiotensin-Ⅱ-induced reactive oxygen species along the SFO-PVN-RVLM pathway：imp lications in neurogenic hypertension［J］.Braz JMed Biol Res，2011，44（9）：871-6.

［7］ Xing T，Pilowsky PM，Fong A Y.Mechanism of sympathetic activation and blood pressure elevation in humans and animals following acute intermittent hypoxia［J］.Prog Brain Res，2014，209：131-46.

［8］ Sharpe A L，Calderon A S，Andrade M A，et al.Chronic intermittent hypoxia increases sympathetic control of blood pressure：role of neuronal activity in the hypothalamic paraventricular nucleus［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2013，305（12）：H1772-80.

［9］ Kc P，Balan K V，Tjoe SS，et al.Increased vasopressin transmission from the paraventricular nucleus to the rostralmedulla augments cardiorespiratory outflow in chronic intermittenthypoxia-conditioned rats［J］.JPhysiol，2010，588（Pt 4）：725-40.

［10］Dergacheva O，Dyavanapalli J，Pinol R A，et al.Chronic intermittent hypoxia and hypercapnia inhibit the hypothalamic paraventricular nucleus neurotransmission to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem［J］.Hypertension，2014，64（3）：597-603.

［11］KnightW D，Saxena A，Shell B，etal.Central losartan attenuates increases in arterial pressure and expression of FosB/ΔFosB along the autonomic axis associated with chronic intermittent hypoxia ［J］.Am JPhysiol Regul Integr Comp Physiol，2013，305（9）：R1051-8.

［12］余孝海，李 艳，丁 扬，等.室旁核血管紧张素Ⅱ在慢性间歇性低氧诱发大鼠高血压中的作用及机制［J］.中国药理学通报，2015，31（5）：716-20.

［13］da Silva A Q，Fontes M A，Kanagy N L.Chronic infusion of angiotensin receptor antagonists in the hypothalamic paraventricular nucleus prevents hypertension in a ratmodel of sleep apnea［J］. Brain Res，2011，1368：231-8.

［14］Braga V A，Medeiros IA，Ribeiro T P，et al.Angiotensin-II-induced reactive oxygen species along the SFO-PVN-RVLM pathway：imp lications in neurogenic hypertension［J］.Braz JMed Biol Res，2011，44（9）：871-6.

［15］Chan SH，Chan JY.Angiotensin-generated reactive oxygen species in brain and pathogenesis of cardiovascular diseases［J］.Antioxid Redox Signal，2013，19（10）：1074-84.

AngiotensinⅡ inparaventricular nucleus contributes to hypertension in chronic interm ittent hypoxia rats by reactive oxygen species

Tang Zhiqing，Fan Yifei，Wang Jinli，etal
（Dept of Physiology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To investigate the effect of Ang II-ROS signal pathway in the hypothalamic paraventricular nucleus（PVN）on chronic intermittent hypoxia（CIH）induced-hypertension in rats.Methods Male SD ratswere randomly divided into control and CIH groups.The control rats were exposed to continuous normoxia，while the CIH rats were submitted to CIH（8 h per day for 15 days）.Ratswere fixed on the stereotaxic instrument to conduct microinjection in the PVN according to Paxinos and Watson rat atlas.Mean arterial pressure（MAP）was recorded in vivo on a PowerLab data acquisition system.We used ELISA kit tomeasure the content of AngⅡ，ROS，totalsuperoxide dismutase（T-SOD）and Western blot tomeasure AngⅡtype 1 receptor（AT1R）protein expression in PVN.Resu lts The contents of PVN ROS（P＜0.05）and AngⅡ（P＜0.01）were significantly higher than that in control rats，alongwith increased AT1R protein expression（P＜0.05）.The activity of PVN T-SOD in CIH ratswas significantly lower than that in control rats（P＜0.01）.Microinjection of AngⅡ（0.3 nmol）in bilateral PVN increased MAP in both CIH and control rats，and this response was significantly augmented in CIH rats（P＜0.01）. ROS scavenger Tempol caused significant MAP decreases in CIH rats than that in control group（P＜0.01）.Tempol prevented AngⅡ-induced increases in MAP in both CIH and control rats，and this response was significantly augmented in CIH rats（P＜0.01）.Conclusion The results suggest that the ROS in PVNmediates the increased blood pressure induced by AngⅡin CIH induced-hypertension rats.

paraventricular nucleus；reactive oxygen species；angiotensinⅡ；chronic intermittenthypoxia；hypertension

R331.36

A

1000-1492（2016）04-0472-05

国家自然科学基金资助项目（编号：81070066）；安徽省教育厅自然科学重点科研项目（编号：KJ2010A176）；安徽医科大学博士科研基金（编号：XJ201221）

安徽医科大学生理学教研室，合肥230032

唐志强，男，硕士研究生；

钟明奎，男，博士，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：zhongmkcn@aliyun.com