VEGF和SLeX表达与甲状腺乳头状癌浸润转移的关系

李永庆尚培中柳勇张星光张进权南润玲谷化平

VEGF和SLeX表达与甲状腺乳头状癌浸润转移的关系

李永庆①尚培中①柳勇①张星光②张进权③南润玲①谷化平①

目的：探讨VEGF和SLeX在甲状腺乳头状癌中的表达及其与癌组织浸润转移的关系。方法：应用免疫组化染色EliVisionTMplus两步法检测164例甲状腺乳头状癌组织和30例癌旁甲状腺组织中VEGF 和SLeX的表达状况。结果：癌组织中VEGF和SLeX总体阳性表达率分别为59.8%（98/164）和70.7% （116/164），癌旁甲状腺组织中VEGF和SLeX总体阳性表达率分别为13.3%（4/30）和6.7%（2/30），两者在癌组织总体阳性表达率显著高于癌旁组织（P＜0.05）；有浸润患者VEGF和SLeX总体阳性表达率分别为69.7%（69/99）和84.8%（84/99），无浸润患者分别为44.6%（29/65）和49.2%（32/65），两者在有浸润患者中的总体阳性表达率均显著高于无浸润患者（P＜0.05）；有淋巴结转移患者VEGF和SLeX总体阳性表达率分别为69.9%（65/93）和89.2%（83/93），无淋巴结转移患者均为46.5%（33/71），两者在有淋巴结转移患者中的总体阳性表达率均显著高于无淋巴结转移患者（P＜0.05）。癌组织VEGF与SLeX表达呈正相关（r=0.59）。结论：VEGF和SLeX在甲状腺乳头状癌组织中多数呈强阳性表达，两者与癌组织浸润转移密切相关。

甲状腺肿瘤； VEGF； SLeX； 浸润； 转移

First-author’s address：The 251st Hospital of Chinese PLA，Zhangjiakou 075000，China

研究发现，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在肿瘤中高表达可刺激新生血管形成，维持其持续生长，促进肿瘤转移。唾液酸化Lewis X（sialyl Lewis X，SLeX）属Lewis血型决定簇Ⅱ型抗原，通过与配体分子选择素结合，可介导与内皮细胞的黏附作用，促进癌细胞转移播散。甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲状腺癌最常见的一种病理类型，几乎所有的儿童甲状腺癌和60%～80%的成人甲状腺癌均为PTC［1-3］。本文采用免疫组化染色EliVisionTMplus两步法检测164例PTC组织VEGF 和SLeX的表达，探讨它们与PTC浸润与转移的关系，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料 选取2009年3月-2016年2月在本院行手术治疗的PTC患者164例，其中男53例，女111例；年龄17～75岁，平均（39.4±11.9）岁。所有患者术前均未曾接受任何相关治疗，行彩超、CT、磁共振等影像学检查了解肿瘤大体情况；术中根据具体探查以及纳米炭混悬液淋巴示踪，按照治疗指南及专家共识确定甲状腺切除和颈淋巴结清除范围；术后根据病理诊断及免疫组化结果，综合判定肿瘤大小、部位，是否有甲状腺包膜、腺体外组织或血管浸润，以及区域淋巴结转移状况。本组有浸润者99例，无浸润者65例。有淋巴结转移者93例，无转移者71例。癌旁组织作为对照组30例，选自距瘤体2 cm的同侧或对侧甲状腺。

1.2纳入标准 入选患者原发癌瘤直径＞1.0 cm，术前针吸细胞学诊断或术中冰冻快速病理诊断为PTC，术中证实未累及气管、食管。所有患者及家属均知情同意并签字，研究方案通过医院伦理委员会批准。

1.3排除标准 （1）直径≤1.0 cm的微小乳头状癌；（2）术前曾接受甲状腺制剂、131I或中药治疗的患者；（3）合并甲状腺炎；（4）伴发其他部位肿瘤；（5）伴发其他部位明显炎性疾病。

1.4手术治疗方法 直径＞1.0 cm的单侧单灶PTC，施行患侧腺叶全切除+峡部切除术、患侧腺叶全切除+峡部切除+对侧腺叶次全/部分切除术，以及全甲状腺切除术；单侧多灶PTC、双侧PTC、有明显腺体外浸润或颈淋巴结转移者，施行近全甲状腺切除或全甲状腺切除术。对低危、中危患者施行选择性颈淋巴结清除术（selective neck dissection，SND），对高危患者施行功能性颈淋巴结清除术（functional neck dissection，FND）或简化的FND。

1.5免疫组化染色方法 即用型鼠抗人VEGF和SLeX单克隆抗体、EliVision试剂盒和均购自福州迈新生物技术开发有限公司。所有手术标本均经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，常规制备4 μm厚连续切片，65 ℃烘烤备用［4］。采用EliVisionTMplus二步法，具体操作步骤：（1）石蜡切片脱蜡和水化后，用微波（micro-wave，MW）5档（输出功率90 W，下同），磷酸盐缓冲液（PBS）洗1 min×3；（2）微波-枸橼酸钠缓冲液（0.01 mol/L，pH值6.0）进行抗原修复，先用MW3档（输出功率150 W）修复抗原2 min，再用MW5档修复抗原2×5 min，待自然冷却至近室温时自来水洗，PBS洗1 min×3；（3）用MW5档，在甲醇-双氧水中封闭内源性过氧化物酶2 min，PBS洗1 min×3；（4）加一抗，4 ℃冰箱过夜，从冰箱中取出后，MW5档5 min，PBS洗2 min×3；（5）加聚合物增强剂，室温下孵育20 min，PBS洗2 min×3；（6）加生物素化的鼠抗人IgG（1∶300），37 ℃、30 min，然后再MW5档5 min，PBS洗2 min×3；（7）3，3’-二氨基联苯胺（Diaminobenzidine，DAB-H2O2）显色10 min；自来水终止显色；（8）苏木素复染0.5～1.0 min；（9）切片常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。免疫组化染色后由两位有经验的病理医师在光学显微镜下进行双盲独立观察，确定染色结果。由福州迈新生物技术开发有限公司提供的阳性染色切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

1.6判定标准 阳性颗粒呈棕黄色或棕褐色。（1）按染色深浅强度评分：无染色0分，棕黄色1分，棕褐色2分；（2）按染色癌细胞所占比例记分：≤30% 1分，31%～70% 2分，≥71% 3分。每例积分为两项记分之和，按高低分3级：阴性（-）0分，弱阳性（+）1～3分，强阳性（++）4～6分。弱阳性和强阳性均计为阳性。

1.7统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1VEGF和SLeX在癌组织及癌旁组织中的表达 阳性物质定位于细胞质和细胞膜。癌组织中VEGF和SLeX总体阳性表达率分别为59.8% （98/164）和70.7%（116/164），其中强阳性表达率分别为33.5%（55/164）和38.4%（63/164），弱阳性表达率分别为26.2%（43/164）和32.3%（53/164），阴性表达率分别为40.2%（66/164）和29.3% （48/164）；癌旁甲状腺组织中VEGF和SLeX总体阳性表达率分别为13.3%（4/30）和6.7%（2/30），其中强阳性表达率分别为3.3%（1/30）和0，弱阳性表达率分别为10.0%（3/30）和6.7%（2/30），阴性表达率分别为86.7%（26/30）和93.3%（28/30）。癌组织与癌旁甲状腺组织比较，VEGF总体阳性表达率、强阳性表达率比较差异均有统计学意义（字2=21.920、11.267，P＜0.05），而弱阳性表达率之间差异无统计学意义（字2=3.688，P＞0.05）。SLeX总体阳性表达率、强阳性表达率和弱阳性表达率比较差异均有统计学意义（字2=43.683、17.067、8.214，P＜0.05），见表1。

2.2VEGF和SLeX表达与浸润转移的关系 有浸润患者VEGF和SLeX总体阳性表达率分别为69.7%（69/99）和84.8%（84/99），其中强阳性表达率分别为38.4%（38/99）和49.5%（49/99），弱阳性表达率分别为31.3%（31/99）和35.4% （35/99），阴性表达率分别为30.3%（30/99）和15.2%（15/99）；无浸润患者VEGF和SLeX总体阳性表达率分别为44.6%（29/65）和49.2% （32/65），其中强阳性表达率分别为26.2%（17/65）和21.5%（14/65），弱阳性表达率分别为18.5% （12/65）和27.7%（18/65），阴性表达率分别为55.4% （36/65）和50.8%（33/65）；有浸润与无浸润患者比较，VEGF总体阳性表达率比较差异有统计学意义（字2=10.264，P＜0.05），强阳性表达率和弱阳性表达率比较差异均无统计学意义（字2=2.633、3.350，P＞0.05）；SLeX总体阳性表达率、强阳性表达率之间差异均有统计学意义（字2=24.045、12.963，P＜0.05），弱阳性表达率之间差异无统计学意义（字2=1.053，P＞0.05）。有淋巴结转移患者VEGF 和SLeX总体阳性表达率分别为69.9%（65/93）和89.2%（83/93），其中强阳性表达率分别为38.7% （36/93）和50.5%（47/93），弱阳性表达率分别为31.2%（29/93）和38.7%（36/93），阴性表达率分别为30.1%（28/93）和10.8%（10/93）；无淋巴结转移患者VEGF和SLeX总体阳性表达率均为46.5% （33/71），其中强阳性表达率分别为26.8%（19/71）和22.5%（16/71），弱阳性表达率分别为19.7% （14/71）和23.9%（17/71），阴性表达率均为53.5% （38/71）；有淋巴结转移与无转移患者比较，VEGF总体阳性表达率比较差异有统计学意义（字2=9.178、P＜0.05），强阳性表达率和弱阳性表达率比较差异均无统计学意义（字2=2.579、2.736，P＞0.05）；SLeX总体阳性表达率、强阳性表达率比较差异均有统计学意义（字2=35.574、13.345，P＜0.05），弱阳性表达率比较差异无统计学意义（字2=3.367，P＞0.05）。见表1。

表1　VEGF和SLeX在甲状腺乳头状癌组织及癌旁组织中的表达

2.3VEGF和SLeX表达的相互关系 VEGF阳性表达的98例中SLeX阳性表达96例（98.0%），VEGF阴性表达的66例中SLeX阳性表达20例（30.3%）。癌组织中VEGF和SLeX表达呈正相关（r=0.59）。

3　讨论

甲状腺是人体重要的内分泌腺，主要功能是合成甲状腺激素，在促进生长发育、新陈代谢、维持心血管系统功能正常运转、提高中枢神经系统兴奋性等方面具有重要作用［5-6］。甲状腺癌系临床常见的头颈部恶性肿瘤，从儿童到老年人均可发病，好发于30～50岁女性，其发病率近年来显著上升并呈现低龄化趋势，现已成为我国发病率增长最快的恶性肿瘤之一，目前在我国女性恶性肿瘤中列第5位，其发病原因与碘摄入量、激素调节、电离辐射、遗传因素、自身免疫、社会因素等多方面原因有关［7-8］。有研究显示，我国从实施食盐加碘措施后，PTC发病率逐渐增高［9］。甲状腺癌绝大部分起源于滤泡上皮细胞，按组织学分类，可分为分化型和未分化型，PTC是分化型甲状腺癌最常见的病理类型，癌组织呈乳头状，间质内存在砂粒体，细胞核中可见核沟［10］。临床实践发现，大多数PTC组织分化较好，恶性程度较低，病情发展缓慢，患者生存期较长，但也有不少患者癌组织具有较高的局部浸润性和区域淋巴结转移率，早期诊断并给予适宜的治疗对改善患者预后具有重要临床意义，高频彩超、螺旋CT等影像学检查有助于诊断，高度怀疑者可行细针穿刺细胞学检查［11-15］。由于PTC对放疗、化疗均不敏感，明确诊断后，分层个体化手术切除是首先治疗措施，规范的首次手术是影响患者预后的主要因素［16-17］。

恶性肿瘤发生发展是多因素、多基因及其表达产物的共同作用，临床病理工作中单纯凭借HE染色观察癌细胞病理组织形态常难以做到精确诊断和分型。由于甲状腺癌发病具有隐匿性，生物学特性具有多变性，仅依靠现有影像学、病理学、细胞学等检查均可能导致误诊，随着分子生物学的发展，业已证实癌基因及其编码蛋白的异常表达与肿瘤形成具有密切关系，寻找敏感性强、特异性高的肿瘤标志物协助鉴别诊断具有实际临床意义［18-19］。近年已发现不少与PTC发生、发展、转归相关的肿瘤标志物，其应用价值在临床诊疗中不断得到肯定。VEGF是一种重要的促血管生成因子，也称血管通透性因子或促血管素，其结构为亚基内及亚基间二硫键交联形成的同型二聚体糖蛋白，与血小板源性生长因子有一定的同源性，可增加小静脉与微血管的通透性，促进血管内皮细胞增殖、迁移，阻止血管内皮细胞凋亡和管腔网状结构退化，增加血管渗透性。它在肿瘤组织中表达水平较高，可促进血管生成和肿瘤转移［20-22］。Lewis血型决定簇抗原与配体分子选择素（selectin），特别是与E-selectin及P-selectin的结合，与白细胞透出血管和肿瘤细胞转移时逸出血管密切相关。SLeX是肿瘤标志物单唾液酸神经节糖苷脂CA19-9（sialyl Lewis A）的同分异构体，主要由岩藻糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰神经氨酸5个分子组成。近年研究表明，SLeX与其配体选择素结合，通过Lewis-selectin转移途径，参与介导癌细胞与血管内皮细胞的黏附作用，是癌细胞浸润及转移过程中的重要途径之一［23-26］。

本组资料表明，VEGF在PTC组织中的总体阳性表达率和强阳性表达率均显著高于癌旁甲状腺组织，差异均有统计学意义（P＜0.05），而弱阳性表达率比较差异均无统计学意义（P＞0.05），表明VEGF 在PTC中的表达大多数呈强阳性，在癌旁甲状腺组织中表达大多数为阴性、弱阳性；SLeX在PTC组织中的总体阳性表达率、强阳性表达率和弱阳性表达率均显著高于癌旁甲状腺组织，差异均有统计学意义（P＜0.05），表明SLeX在PTC中的表达大多数呈阳性，在癌旁甲状腺组织中表达大多数为阴性。VEGF和SLeX在癌组织和癌旁甲状腺组织的不同表达，证实它们在甲状腺良恶性病变的鉴别诊断中具有较可靠的实际应用价值。在有浸润和有淋巴结转移患者中，VEGF总体阳性表达率、SLeX总体阳性表达率和强阳性表达率均显著高于无浸润和无淋巴结转移患者，表明两者均参与了癌细胞生长、凋亡、黏附、新生血管形成和浸润转移，在PTC的发生发展、浸润转移过程中发挥了一定作用，并且SLeX在非癌甲状腺组织向PTC癌组织转变过程中以及从癌组织无浸润向有浸润、从癌细胞无转移向有转移的发展过程中发挥的作用意义可能较VEGF更为突出。清除主要转移区域的淋巴结，观察其病理形态学特征，通过联合监测VEGF和SLeX等肿瘤标志物的表达状况，有助于精准评估临床分期及病理分级。笔者还观察到，VEGF和SLeX在PTC组织中表达呈正相关，提示它们在PTC恶性发展过程中可能具有协同调节作用。深入探讨两者在PTC浸润、转移过程中的作用机制，有助于深入了解其临床病理进程，科学客观地判断其生物学特性、尤其是浸润能力和转移潜能，对评估患者预后、指导临床综合治疗、降低复发率及转移率等具有一定意义，也可能为PTC的靶向治疗提供新途径。

［1］尚培中，张进权，枊勇.分化型甲状腺癌的诊断与规范化手术治疗［J］.临床误诊误治，2015，28（6）：44-47.

［2］苗建军，尚培中，张进权，等.简化的功能性颈部淋巴结清除术治疗甲状腺乳头状癌42例体会［J］.中国现代普通外科进展，2015，18（3）：230-231，237.

［3］谢锐.甲状腺结节385例的诊疗体会［J］.中外医学研究，2015，13（16）：107-108.

［4］张进权，尚培中，柳勇，等.COX-2和CK19表达与甲状腺乳头状癌浸润转移的关系［J］.中国现代普通外科进展，2015，18（11）：902-904.

［5］段海玲.甲状腺占位性病变采用超声诊断的临床价值［J］.中外医学研究，2015，13（3）：66-67.

［6］孙有利.甲状腺功能在老年心力衰竭患者中的预测作用分析［J］.中外医学研究，2015，13（11）：55-56.

［7］周捷.腔镜辅助甲状腺切除手术治疗分化型甲状腺癌的临床研究［J］.中外医学研究，2015，13（11）：47-48.

［8］吴峰，程旭锋，邢栋.扶正祛邪法对甲状腺癌患者术后的临床观察［J］.中国医学创新，2015，12（6）：106-108.

［9］张方曙，邹祥.76例甲状腺癌患者临床与病理的回顾性分析［J］.中外医学研究，2015，13（13）：95-96.

［10］宋锦丽，庞华.甲状腺球蛋白在分化型甲状腺癌预后中的意义［J］.中国医学创新，2015，12（13）：150-153.

［11］葛新.彩色多普勒超声在甲状腺癌诊断与鉴别诊断中的应用价值［J］.中国医学创新，2014，11（32）：59-61.

［12］孙若晶.超声对甲状腺癌和甲状腺腺瘤的诊断和鉴别诊断价值分析［J］.中国医学创新，2014，11（10）：53-55.

［13］谢强，雷海花，丁淑敏，等.甲状腺结节病变的CT诊断与分析［J］.中国医学创新，2015，12（4）：109-112.

［14］袁明，徐月阳.B超引导下活检针穿刺对可疑甲状腺癌结节的诊断意义［J］.中国医学创新，2014，11（17）：33-35.

［15］王彦宝.甲状腺细针穿刺病理诊断的临床应用价值［J］.中外医学研究，2015，13（15）：71-72.

［16］尚培中，苗建军，徐志勇，等.甲状腺乳头状癌157例手术治疗体会［J］.中国现代普通外科进展，2012，15（8）：649-651.

［17］尚培中，柳勇，南润玲.甲状腺乳头状癌的诊断与治疗［J］.中国现代普通外科进展，2015，18（10）：833-836.

［18］董子龙，张生彬，武妍婷.甲状腺乳头状癌miR-34b基因表达及其启动子区甲基化的临床意义研究［J］.中国医学创新，2014，11（11）：1-3.

［19］杜岗，马艳波.CK19、Galectin-3在甲状腺良恶性肿瘤中的表达及其临床意义［J］.中国医学创新，2014，11（17）：15-17.

［20］陈静，汪鸿志.血管内皮生长因子的研究进展［J］.中华内科杂志，1998，37（1）：62-64.

［21］谷化平，尚培中.EGFR、VEGF和PTEN在结直肠癌中表达及与其临床病理特征的关系［J］.实用癌症杂志，2011，26 （3）：259-262.

［22］谷化平，尚培中.环氧化酶-2和血管内皮生长因子蛋白表达与甲状腺乳头状癌转移和预后的关系［J］.中华内分泌外科杂志，2012，6（4）：225-227.

［23］李永庆，尚培中，苗建军，等.CD15s和E-cadherin表达与肝细胞癌侵袭转移相关性研究［J］.河北北方学院学报（医学版），2009，26（6）：5-7.

［24］王兵，尚培中，谷化平.甲状腺乳头状癌SLeX和nm23H1表达对照研究［J］.中国医学创新，2009，6（20）：50-51.

［25］尚培中，王兵，万立，等.SLeX和p16在甲状腺乳头状癌中的表达及其意义［J］.中华内分泌外科杂志，2009，3（3）：151-153.

［26］王首星，尚培中.结直肠癌Lewis-Selectin转移途径与西咪替丁抗癌治疗研究进展［J］.中国普外基础与临床杂志，2010，17（7）：760-764.

Expressions of VEGF and SLeX in Papillary Thyroid Carcinoma and Their Relationships with Invasion and Metastasis

LI Y ong-qing，SHANG Pei-zhong，LIU Y ong，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（21）：005-009

Objective：To investigate the expressions of VEGF and SLeX in papillary thyroid carcinoma and their relationships with the potential of invasion and metastasis.Method：The expressions of VEGF and SLeX in 164 cases of papillary thyroid carcinoma and 30 cases of para-tumorous tissue were studied by EliVisionTMplus twostep immunohistochemical method.Result：The positive rates of VEGF and SLeX in papillary thyroid carcinoma were 59.8%（98/164）and 70.7%（116/164），both were significantly higher than those in para-tumorous tissue （P＜0.05）.The positive rates of VEGF and SLeX in the patients with tumor invasion were 69.7%（69/99）and 84.8%（84/99），both were significantly higher than those in without tumor invasion（P＜0.05）.The positive rates of VEGF and SLeX in the patients with lymphatic metastasis were 69.9%（65/93）and 89.2%（83/93），both were significantly higher than those in without lymphatic metastasis（P＜0.05）.There was a positive correlation between VEGF and SLeX expression（r=0.59）.Conclusion：High level expressions of VEGF and SLeX in papillary thyroid carcinoma are closely correlated with the invasive and metastasic potential.

Thyroid neoplasms； VEGF； SLeX； Invasion； Metastasis

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.21.002

①中国人民解放军第251医院 河北 张家口 075000
②中国人民解放军陆军总医院
③河北省蔚县人民医院

尚培中

2016-04-19） （本文编辑：程旭然）