反相高效液相色谱法测定消渴平片中黄芪甲苷的含量Δ

周颖仪，刘潇潇

(广东省药品检验所中成药室，广东 广州　510180)



反相高效液相色谱法测定消渴平片中黄芪甲苷的含量Δ

周颖仪*，刘潇潇#

(广东省药品检验所中成药室，广东 广州510180)

目的：建立消渴平片中黄芪甲苷含量的测定方法。方法：采用薄层色谱法对制剂中黄连、葛根进行定性鉴别。采用反相高效液相色谱法测定制剂中黄芪甲苷的含量：色谱柱为Thermo BDS Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(V∶V=32 ∶68)，流速为1 ml/min，柱温为30 ℃，检测采用蒸发光散射检测器。结果：定性鉴别专属性强，阴性无干扰；黄芪甲苷质量范围在0.196 2～10.172 0 μg之间与峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 8，平均回收率为100.7%，RSD为2.1%(n=9)。结论：本研究结果准确、重复性好，能有效控制该制剂的质量。

消渴平片； 反相高效液相色谱法； 黄芪甲苷

消渴平片由黄芪、黄连、葛根等12味中药组成，具有益气养阴、清热泻火之效，临床用于阴虚燥热、气阴两虚所致的消渴病，症见口渴喜饮、多食、多尿、消瘦、气短、乏力、手足心热，以及2型糖尿病见上述症候者。消渴平片为《中华人民共和国药典》(2015年版)任务品种，该品种原质量标准收载于《中华人民共和国药典：一部》(2010年版)第1 042页。本研究根据《2015年版药典科研立任务单》的要求，采用薄层色谱法对消渴平片中黄连、葛根进行定性鉴别，使用反相高效液相色谱法对制剂中黄芪的黄芪甲苷进行定量测定，综合评价该制剂的质量，为该制剂提供简便、可靠的质量控制方法。

1　材料

1.1仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪；Alltech ELSD 2000ES型蒸发光检测器；Sartorius-CP225D、Sartorius-CP224S电子天平；色谱柱：Thermo BDS Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Merck Purospher©STAR RP-18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，资生堂C18 ACR C18(6 mm×250 mm，5 μm)。预制硅胶G薄层板，购于Merck公司、青岛海洋化工厂分厂及烟台市化学工业研究所。

1.2药品与试剂

消渴平片(广州中一药业有限公司，批号：R00001、R00002、R00003；康普药业股份有限公司，批号：20121109、20110809、20110523；吉林万通药业集团梅河药业股份有限公司，批号：20110901、20111201；长春英平药业有限公司，批号：20120901)；黄芪甲苷对照品(批号：110781-200613)、黄连对照药材(批号：913-200910)、盐酸小檗碱对照品(批号：110713-200910)、葛根(甘葛藤)对照药材(批号： 1175-200001)、葛根素(批号：110752-200912)均购于中国食品药品检定研究院，阴性样品为本实验室自制。乙腈为色谱纯，水为纯化水，其余试剂级别均为分析纯。

2　方法与结果

2.1定性鉴别

2.1.1黄连的薄层鉴别：取本品2片，研细，加氨水2 ml润湿，再用三氯甲烷液20 ml，超声处理30 min，放冷，滤过，蒸干滤液，残渣加1.5 ml甲醇使之溶解，作为供试品溶液。另取黄连对照药材0.25 g，加25 ml甲醇，超声处理(350 W，35 Hz)30 min，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液[1]。再取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇溶解使成每1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。取缺黄连的阴性样品，按供试品溶液的制备方法同法制成缺黄连阴性样品溶液。吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液、缺黄连阴性样品溶液各1 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水 (V∶V∶V∶V∶V=6.0 ∶3.0 ∶2.0 ∶1.5 ∶0.3)为展开剂，置于用浓氨溶液预饱和20 min的展开缸里，展开，取出，晾干，在紫外光(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，见图1。

1～6.供试品； 7.黄连对照药材； 8.对照品； 9.阴性样品1-6.Test sample; 7.Coptidis Rhizoma reference herb; 8.Reference substance; 9.Negative sample图1　黄连薄层色谱图Fig 1　TLC chromatogram of Coptidis Rhizoma

2.1.2葛根的薄层鉴别：取本品20片，研细，加热水适量使其溶解，放冷，加硅藻土适量，加乙酸乙酯100 ml，超声30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加2 ml甲醇使其溶解，作为供试品溶液[2]。另取葛根对照药材0.5 g，加20 ml甲醇，放置2 h，滤过，蒸干滤液，残渣加甲醇1.5 ml使其溶解，取续滤液，作为对照药材溶液。再取葛根素对照品，加甲醇溶解，制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。取缺葛根的阴性样品，按供试品溶液的制备方法同法制成缺葛根阴性样品溶液。吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液、缺葛根阴性样品溶液各2 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(V∶V∶V=7.00 ∶2.50 ∶0.25)为展开剂[3]，展开，取出，晾干，在紫外光(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，见图2。

1～6.供试品； 7.葛根对照药材； 8.对照品； 9.阴性样品1-6.Test sample； 7.Puerariae lobatae radix reference herb；8.Reference substance； 9.Negative sample图2　葛根薄层色谱图Fig 2　TLC chromatogram of Puerariae Lobatae Radix

2.2含量测定

2.2.1色谱条件：色谱柱为Thermo BDS Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-水(V∶V=32 ∶68)[3]为流动相；流速为1 ml/min；柱温为30 ℃；蒸发光散射检测器检测；氮气流量为2.5 L/min；漂移管温度为105 ℃时的色谱条件对黄芪甲苷的分离较好，灵敏度高，分析时间短。

2.2.2对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，即得。

2.2.3供试品溶液的制备：取本品，研细，取约6 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加50 ml甲醇，加热回流45 min，放冷，过滤，用少量甲醇分次洗涤锥形瓶及滤纸，滤液和洗液合并，蒸干，残渣加水20 ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40 ml，合并正丁醇提取液液，用氨试液洗涤2次，每次40 ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.4缺黄芪阴性样品溶液的制备：按供试品溶液的制备方法制成缺黄芪阴性样品溶液。

2.2.5专属性考察：吸取对照品溶液、供试品溶液与缺黄芪阴性样品溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，结果显示，缺黄芪阴性样品无干扰，表明专属性良好，见图3。

2.2.6线性关系考察：分别配制0.019 62、0.058 86、0.196 20、0.392 40、0.508 60、1.017 20 mg/ml黄芪甲苷系列对照品溶液，设定进样体积为10 μl，以峰面积的对数(Y)为纵坐标，质量的对数(X) 为横坐标进行线性回归，得黄芪甲苷的回归方程为：Y=1.543 7X+7.223 5，r=0.999 8。结果表明，黄芪甲苷质量范围在0.196 2～10.172 0 μg之间与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.7精密度(重复性试验)：取本品(批号为R0001)，研细，取约6 g，共取6份，精密称定，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，6次操作之间的RSD为4.5%(n=6)，说明本方法重现性良好。

A.对照品； B.供试品； C.缺黄芪阴性样品A.Reference substance; B.Test sample; C.Negative sample without Astragali Radix图3　高效液相色谱图Fig 3　HPLC chromatogram

2.2.8准确度(加样回收率试验)：取本品(批号为R0001，含黄 芪甲苷0.436 7 mg/g)9份，每份3 g(含黄芪甲苷1.310 10 mg)，分别按相当于该批号消渴平片中黄芪甲苷含量约80%(1.048 08 mg)、100%(1.310 10 mg)、120%(1.572 12 mg)各3份加入黄芪甲苷对照品，按含量测定方法测定，计算黄芪甲苷的回收率。结果显示，平均回收率为100.7%，RSD为2.1%(n=9)，说明方法的准确度较好。

2.2.9样品含量测定：取来自4个企业的9批消渴平片，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算结果见表1。

3　讨论

3.1黄连薄层鉴别

以黄连对照药材和盐酸小檗碱为对照，制订黄连的薄层鉴别方法。分别考察了4种展开剂：(1)环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(V∶V∶V∶V∶V∶V=3.0 ∶3.5 ∶1.0 ∶1.5 ∶0.5 ∶1.0)[1]；(2)乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水 (V∶V∶V∶V=10 ∶7 ∶7 ∶1)[4]；(3)正丁醇-冰醋酸-水 (V∶V∶V=7 ∶1 ∶2)[5]；(4)甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水 (V∶V∶V∶V∶V=6.0 ∶3.0 ∶2.0 ∶1.5 ∶0.3)[6]。结果表明，展开剂(1)斑点不清晰，Rf值偏低；展开剂(2)斑点Rf值偏高；展开剂(3)斑点清晰，Rf值偏适中；展开剂(4)斑点清晰， Rf值偏适中，且信息量优于展开剂(3)，因此，选择展开剂(4)作为该薄层色谱的展开剂。

表1　样品测定结果(n=9)Tab 1　Determination results of samples (n=9)

3.2黄芪甲苷的含量测定

根据《中华人民共和国药典》(2010年版)黄芪药材中黄芪甲苷的含量测定方法，进一步优化，采用反相高效液相色谱法测定制剂中黄芪甲苷的含量。对于提取方法，考察了索氏提取(4 h)、超声处理(1 h)、加热回流提取(1 h)3种方法[7-9]，结果表明，加热回流提取1 h所得的黄芪甲苷含量较高，确定提取方法为加热回流。对于提取时间，考察了加热回流15、30、45、60 min，结果表明，加热回流45 min所提取的黄芪甲苷含量较高，确定加热回流提取时间为45 min。还考察了是否通过预处理好的D101大孔树脂[10-12]，结果表明，通过D101大孔树脂与不通过D101大孔树脂的供试品溶液测得的黄芪甲苷含量相近，从简便操作考虑，选择不通过D101大孔树脂的提取方法。本品为薄膜衣片，考虑到除去包衣会增加检验步骤，并会造成误差，故对是否除去包衣进行考察，结果表明，样品除去与不除去包衣所测得黄芪甲苷的含量差异不大，为方便操作，采用不去包衣取样。

3.3不同来源样品的差异

观察不同来源样品所测得结果，可以发现部分供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，虽然显示相同颜色的荧光斑点，但其斑点较为模糊，说明含量较低。另外在黄芪甲苷的含量测定中，不同来源的黄芪甲苷含量存在一定的差异，其中长春英平药业有限公司的消渴平片含量最低，与其他来源的差别较大。

综上所述，本研究在《中华人民共和国药典》(2010年版)消渴平片标准的基础上，加以改进[13-15]。其中，薄层色谱法鉴别黄连、葛根操作方便、专属性强，反相高效液相色谱法测定黄芪甲苷的含量结果准确，方法简便、稳定、专属性强、重复性好，可以用于消渴平片的质量控制。

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[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010年版.北京：化学工业出版社，2010:283-284,312-313.

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[8]江延辉.HPLC-ELSD法测定复方芪参片中黄芪甲苷的含量[J].中医现代中药,2013,15(4):314-316.

[9]郭强.HPLC-ELSD法测定老年咳喘片中黄芪甲苷的含量[J].中医研究,2013,26(6):76-78.

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Content Determination of Astragaloside in Xiaokeping Tablets by RP-HPLCΔ

ZHOU Yingyi, LIU Xiaoxiao

(Dept.of Chinese Patent Medicine, Guangdong Institute for Drug Control, Guangdong Guangzhou 510180, China)

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of astragaloside in Xiaokeping tablets by RP-HPLC. METHODS: TLC method was used for the qualitative identification of coptidis rhizoma and puerariae lobatae radix. RP-HPLC was used to simultaneously determine the content of astragaloside in Xiaokeping tablets. The chromatographic column was Thermo BDS Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm), the mobile phase was acetonitrile-water(V∶V=32 ∶68), with flow rate of 1 ml/min and column temperature of 30 ℃, and the detectors were evaporative light-scattering detector (ELSD). RESULTS: The qualitative identification was specific without interference in the negative reference. The linear range was 0.196 2-10.172 0 μg,r=0.999 8 for astragaloside. The average recovery rate was 100.7%,RSDwas 2.1% (n=9). CONCLUSIONS: The result of this study is accurate and reproducible, which can be used for quality control of Xiaokeping tablets.

Xiaokeping tablets; RP-HPLC; Astragaloside

2016-02-19)

广东省省级科技计划项目(No.201313040200029)

副主任药师。研究方向：中药质量标准提高。E-mail：cpulxx@126.com

R927.2

A

1672-2124(2016)07-0886-04

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.07.008

*药师。研究方向：药品质量控制。E-mail：wingwa.2008@163.com