海马区Fas蛋白表达与糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的相关性Δ

陈　培，滕艳杰，杨旭芳，杨晓帆

(1.牡丹江医学院病理生理教研室，黑龙江 牡丹江　157011； 2.牡丹江医学院医药研究中心，黑龙江 牡丹江　157011； 3.牡丹江医学院红旗医院神经内科，黑龙江 牡丹江　157011)



海马区Fas蛋白表达与糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的相关性Δ

陈培1*，滕艳杰2，杨旭芳1，杨晓帆3#

(1.牡丹江医学院病理生理教研室，黑龙江 牡丹江157011； 2.牡丹江医学院医药研究中心，黑龙江 牡丹江157011； 3.牡丹江医学院红旗医院神经内科，黑龙江 牡丹江157011)

目的：探讨海马区Fas蛋白表达与糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的相关性。方法：选取健康雄性大鼠30只，以随机数字表法分为正常对照组、脑缺血再灌注组、糖尿病脑缺血再灌注组各10只。采用线栓法构造大鼠脑中动脉闭塞模型，并采用苏木精-伊红染色法观察海马CA1神经元缺失情况，采用免疫组化法检测Fas蛋白表达量。结果：苏木精-伊红染色结果中，正常对照组未观察到细胞凋亡和神经元缺失，而脑缺血再灌注组和糖尿病脑缺血再灌注组大鼠均观察到细胞凋亡和神经元缺失，其中糖尿病脑缺血再灌注组大鼠神经元缺失较为严重；正常对照组仅观察到极少量的Fas染色阳性细胞，而糖尿病脑缺血再灌注组和脑缺血再灌注组大鼠可以较为明显地观察到Fas染色阳性细胞，且糖尿病脑缺血再灌注组大鼠Fas蛋白表达显著高于脑缺血再灌注组。结论：糖尿病局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠海马区神经元Fas蛋白的表达较为明显，Fas蛋白介导的细胞凋亡是海马神经元损伤的重要机制之一。

海马区； Fas蛋白； 糖尿病； 脑缺血再灌注损伤

糖尿病是一种机体慢性代谢疾病，不仅与脑血管发病有关，还与神经系统的损伤有密切关联，是导致认知功能障碍的独立危险因素[1]。研究结果表明，脑缺血再灌注损伤也是导致认知障碍的关键因素[2]，脑缺血再灌注损伤容易引发神经元凋亡，而Fas蛋白作为细胞凋亡的重要信号转导系统，国内关于其在海马神经元组织的表达及机制研究的报道较少。本研究探讨糖尿病大鼠脑缺血再灌注海马神经元损伤中Fas蛋白不同时间点的表达情况及其与神经元损伤的关系，现报告如下。

1　材料

1.1仪器

强生稳豪倍易型血糖仪[强生(中国)医疗器材有限公司]；Fas免疫组化检测试剂盒(武汉博士德生物工程公司)；LIOO S600 系列生物显微镜(北京京昊永成商贸有限公司)。

1.2药品与试剂

链脲佐菌素[生兴生物技术(南京)有限公司，纯度≥95%； 熔点：121 ℃；规格：100 mg；批号：X20140733]；水合氯醛(上海士锋生物科技有限公司，批号：F01038742)。

1.3动物模型

30只健康雄性Wister大鼠，由牡丹江市医科大学基础试验动物中心提供，大鼠均处于2～3月龄，体质量200～250 g，以随机数字表法分为正常对照组、脑缺血再灌注组、糖尿病脑缺血再灌注组各10只。

1.3.1脑缺血再灌注组：大鼠局灶性脑缺血再灌注模型采用线栓法和环扎法完成，采用神经评分判定，大鼠左侧肢体瘫痪或者行走向右旋转为实验大鼠[3]。

1.3.2糖尿病脑缺血再灌注组：大鼠禁食8 h后，分别于左腹腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，3 d后进行血糖测定，取大鼠尾尖血液，空腹血糖水平≥16.7 mmol/L表示具有糖尿病[4]。针对糖尿病大鼠，不采取胰岛素干预，动态观察糖尿病大鼠的症状及体征变化。在此基础上，按照“1.3.1”方法建立糖尿病脑缺血再灌注组动物模型。

1.4方法

3组实验动物经10%水合氯醛麻醉后，分别在左心室插管下灌入0.9%氯化钠溶液和4%多聚甲醛各100 ml，处死并取脑，制作标本后采用4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液进行固定，固定处理24 h后，进行酒精脱水并低温石蜡包埋。组织连续快速切片，切片厚度5 μm，进行常规苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色处理。依据Fas免疫组化检测试剂盒说明进行Fas蛋白免疫组化，以磷酸盐缓冲液(0.01M PBS)作为阴性对照组，同时每张切片海马区的阳性细胞观察在400倍光镜下处理，随机选取8个互不重叠的视野观察。

2　结果

2.1HE染色结果

正常对照组大鼠未观察到明显的神经细胞凋亡；2 d后，观察到脑缺血再灌注组大鼠海马CA1区神经元明显减少；糖尿病脑缺血再灌注组大鼠海马CA1区神经元减少更为严重，见图1。

2.2免疫组化结果

正常对照组大鼠Fas蛋白表达量极少，而脑缺血再灌注组大鼠Fas染色阳性细胞较多，糖尿病脑缺血再灌注组大鼠Fas染色阳性细胞表达量显著高于脑缺血再灌注组，见图2。

A.正常对照组； B.脑缺血再灌注组； C.糖尿病脑缺血再灌注组A.Normal control group; B.Cerebral ischemia-reperfusion group; C.Diabetes, cerebral ischemia-reperfusion group图1　海马区神经元凋亡观察图Fig 1　Hippocampus neuronal apoptosis

D.正常对照组； E.脑缺血再灌注组； F.糖尿病脑缺血再灌注组D.Normal control group; E.Cerebral ischemia-reperfusion group; F.Diabetes, cerebral ischemia-reperfusion group图2　海马区Fas蛋白表达情况Fig 2　Hippocampus Fas protein expression

3　讨论

糖尿病不仅是缺血性脑血管病发病的独立危险因素，还在一定程度上影响着缺血性脑血管病的神经元损伤状况[5-7]。近年来，随着人们生活方式的改变，糖尿病患者的数量也不断增加，糖尿病成为了医疗诊治中广受关注的疾病，其具有较高的致残率、致死率，也是引发脑血管疾病的关键因素，对患者认知功能有一定的影响[8-9]。因此，深入研究糖尿病脑缺血再灌注神经元细胞损伤的机制具有积极的现实意义。

Fas蛋白是一种细胞表面蛋白，又称为CD95，细胞凋亡主要是通过Fas配体与Fas靶细胞集合而起作用[10-11]，在糖尿病脑缺血患者的神经组织中，Fas蛋白是机体细胞凋亡信号转导系统的关键。糖尿病大鼠的海马神经元会出现椎体细胞核固缩、线粒体肿胀、染色质粒化等异常症状，这些症状是神经细胞凋亡的典型特征[12-13]。本研究中，糖尿病脑缺血再灌注组大鼠的海马CA1区神经元Fas不断上调，在2 d后出现高峰表达状态，显著高于脑缺血再灌注组。糖尿病脑缺血再灌注组与脑缺血再灌注组的HE染色变化趋势基本一致，但糖尿病脑缺血再灌注组神经染色细胞较为显著，说明高血糖在一定程度上能够增强Fas活性。因此，糖尿病脑缺血再灌注由于Fas介导的神经元凋亡机制导致了神经元损伤，进一步研究Fas与神经元细胞凋亡其他信号间的关系，可以寻找有效的Fas抑制剂，从而明显减轻Fas蛋白对糖尿病海马区缺血神经的损伤，该研究方向是今后局灶性脑缺血再灌注神经元损伤的探索重点。

综上所述，海马区Fas蛋白表达与局灶性脑缺血再灌注损伤密切相关，也是导致糖尿病脑缺血后出现认知障碍的关键因素，临床应加强对Fas蛋白的表达机制及其抑制机制的研究。

[1]丁欣，张季生，吴军，等.Fas蛋白在糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后海马区的表达及意义[J].解剖科学进展，2008，14(3)：284-286.

[2]张尔枫.糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后海马区Fas和Tau蛋白的表达意义[D].沈阳：中国医科大学，2005.

[3]张季声，丁欣，吴军，等.糖尿病大鼠脑缺血再灌注海马CAl区Fas蛋白的表达[J].中国生物制品学杂志，2007，20(6)：413-415.

[4]丁欣，陈晓敏，吴迪宾，等.依达拉奉对糖尿病大鼠脑缺血再灌注海马区神经元凋亡的影响[J].中国老年学杂志，2014，34(16)：4595-4597.

[5]郑广顺，高亮，杨涌杰，等.降钙素基因相关肽对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织P53蛋白表达的调节作用[J].解剖科学进展，2005，11(1)：19-21.

[6]谢柏梅，傅卫红，徐朝霞.慢性阻塞性肺疾病大鼠呼吸、认知功能和海马区脑代谢物之间相关性研究[J].国际呼吸杂志，2015，35(5)：342-346.

[7]贺丽蓉，邵晓珊，李宇红，等.Fas/FasL在原发性肾小球疾病患儿肾组织中的表达[J].贵州医药，2015，39(3)：210-213.

[8]张瑞凤，刘艳清，王艳玲.三磷酸胞二钠对大鼠局灶性脑缺血再灌注后Fas蛋白表达的影响[J].中国煤炭工业医学杂志，2005，8(7)：783-784.

[9]赵志伟.大鼠肢体缺血-再灌注后海马Fas蛋白表达的变化[D].石家庄：河北医科大学，2005.

[10]何倩，李花，周小青，等.丹龙醒脑片对大鼠脑缺血再灌注后海马区AI及Fas/FasL、TNF-α表达的影响[J].湖南中医药大学学报，2009，29(2)：23-25.

[11]左艳丽，于凌志，贾孟辉，等.Fas/FasL系统与脑缺血再灌注损伤相关性的研究进展[J].医学信息，2016，29(5)：26-27.

[12]李建民，赵雅宁，刘乐，等.高血压大鼠全脑缺血再灌注后海马区c-Jun氨基末端激酶激活与GRP78表达的关系[J].医学研究生学报，2014，27(5)：473-477.

[13]王军，陈静，张冬秀，等.缺氧缺血性脑损伤大鼠脑组织海马区p-tau蛋白与凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的关系[J].山东医药，2014，54(45)：1-3.

Correlation of Hippocampus Fas Protein Expression and Diabetes Focal Cerebral Ischemia Reperfusion Injury in RatsΔ

CHEN Pei1, TENG Yanjie2, YANG Xufang1, YANG Xiaofan3

(1.Dept.of Physiology and Physiology, Mudanjiang Medical College, Heilongjiang Mudanjiang 157011, China; 2.Medical Research Center, Mudanjiang Medical University, Heilongjiang Mudanjiang 157011, China; 3.Dept.of Internal Medicine-Neurology, Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical College, Heilongjiang Mudanjiang 157011, China)

OBJECTIVE：To probe into the correlation of hippocampus Fas protein expression and diabetes focal cerebral ischemia reperfusion injury in rats. METHODS: 30 healthy male rats were randomly selected and divided into normal control group (n=10), cerebral ischemia reperfusion group (n=10), diabetes cerebral ischemia reperfusion group (n=10). MCAO was established by thread approach, CA1 neuronal loss was observed by HE staining, and Fas protein expression was detected by immunohistochemistry. RESULTS: HE staining results in the normal control group showed no apoptosis and neuronal loss, and cerebral ischemia reperfusion group and diabetes cerebral ischemia reperfusion group were observed apoptosis and neuronal loss, and the neuronal loss in diabetic cerebral ischemia reperfusion group were relatively severe. A small amount of Fas staining positive cells were observed in normal control group, yet Fas staining positive cells cerebral were clearly observed in ischemia reperfusion group and cerebral ischemia reperfusion group; and the Fas protein expression in diabetic cerebral ischemia reperfusion group was higher than that in cerebral ischemia reperfusion group. CONCLUSIONS: The diabetic rat focal cerebral ischemia reperfusion injury in the hippocampus neuron Fas protein expression is relatively apparent, Fas protein mediated apoptosis is one of the important mechanisms of hippocampal neuron damage.

Hippocampus; Fas protein; Diabetes; Cerebral ischemia reperfusion injury

2016-04-14)

牡丹江市科学技术计划项目(No.z2014s023)；牡丹江医学院科学技术研究项目(No.zs201511)

主治医师。研究方向：脑老化与脑血管病。E-mail:qingqingfanying@sina.com

R743.31

A

1672-2124(2016)07-0894-03

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.07.011

*讲师。研究方向：脑老化与脑血管病。E-mail:hongmeisu@163.com