烟草野火病与角斑病生防菌株的筛选

刘宇帅，张淑梅，曹　旭，胡基华，姜　威，孟利强，陈静宇，李　晶

（1.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨 150001；2.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010）

烟草野火病与角斑病生防菌株的筛选

刘宇帅1，2，张淑梅1，2，曹旭1，2，胡基华1，2，姜威1，2，孟利强1，2，陈静宇1，2，李晶1，2

（1.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨 150001；2.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010）

本研究通过室内平板拮抗作用实验，筛选对烟草细菌病害具有较好防治作用的生防菌株，并对其拮抗作用及复合菌剂进行研究。筛选到一株对烟草野火病菌具有拮抗作用的生防菌株CZS，抑菌圈平均直径为25.92mm；一株对烟草角斑病菌具有拮抗作用的生防菌株18，抑菌圈平均直径为28.76mm。此外，通过不同配比复合菌剂的抑菌实验表明，无论是针对野火病菌还是角斑病菌，生防细菌CZS、18以2：1配比而得的复合菌剂抑菌效果最明显。

烟草细菌病害；生防菌；筛选；拮抗作用

近年来，烟草的病虫害危害问题日益突出，严重危害烟株叶片并影响烟叶质量，已造成巨大的经济损失。野火病和角斑病是烟草主要的细菌病害，野火病是一种由烟草假单胞杆菌 （Pseudomonas syringae pv.tabaci）引起，由Wolf和Foser首次报道，该病最早发现于美国的弗吉尼亚和北卡罗莱纳州［1］。20世纪40年代末该病害在中国云南烟区零星发生，而后随着烟草栽培面积的扩大而渐趋严重［2］。烟草角斑病病原菌为假单胞杆菌，属丁香假单胞菌，烟草致病变种不产生野火毒素菌系［3］。由于天气原因，野火病与角斑病经常混合发生，病害流行年份可造成重大损失，甚至导致绝收。由于这些病原菌存活力强，采用轮作或田间消除病残体等栽培措施预防病害的发生具有相当大的难度［4］。利用化学药剂防治，不仅会造成环境污染和烟叶内的农药残留，而且防治效果也难以保证。因此，生物防治方法越来越受到人们的重视。为此，笔者筛选出对烟草野火病和角斑病具有拮抗作用的生防菌，并对其复合菌剂进行研究。

1　材料与方法

1.1材料

培养基∶LB培养基（胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1 000mL，若固体培养基需加琼脂15g，pH 7.0）。

菌株∶烟草野火病和角斑病菌由牡丹江烟草科学研究所赠送，供实验筛选所用细菌菌株均为实验室保藏的生防菌株。

1.2生防菌株的筛选

将实验室现有保藏的生防细菌菌株挑取单菌落分别接于5mL LB试管中，于30℃、170 r/min振荡器中培养70 h待用。将保藏的病原菌以2%的接种量分别取100μL接于5 mL LB试管中，30℃、170 r/min振荡器中培养16h。分别取100μL病原菌菌液均匀涂满于LB培养基平板上，然后用灭菌后的牙签分别蘸取各生防菌液点接于培养基上。设未接生防菌液为对照组，重复3次，于30℃培养箱中培养。每天对病原菌生长情况进行观察。

1.3生防菌株的抑菌能力测定

采用与1.2中同样的方法，将病原菌和初筛获得的生防细菌进行培养。分别取100μL病原菌菌液均匀涂满于LB培养基平板上，然后取灭菌后的牛津杯置于各平板中，并在其中加入生防菌液各100μL。设未加生防菌液为对照组，重复3次，于30℃培养箱中培养。每天对病原菌生长情况进行观察，测量抑菌圈大小。

1.4复合菌剂的配制及抑菌能力测定

生防细菌与病原菌的培养同1.2，将两种生防菌液按1∶1、2∶1、1∶2的体积比进行混合，配制成三种复合菌剂，按1.3中的方法进行抑菌实验。

2　结果与分析

2.1烟草野火病、角斑病生防菌株的筛选

通过平板抑菌实验，对实验室现有的生防菌株抑菌能力进行测定，筛选出一株对野火病具有抑菌能力的枯草芽孢杆菌CZS，一株对角斑病具有抑菌能力的甲基营养型芽孢杆菌18。

2.2菌株CZS对烟草野火病病原菌的拮抗作用

通过室内平板拮抗作用实验对菌株CZS的拮抗作用进行测定，结果表明在培养2d后，对照组中野火病菌生长旺盛，菌落布满整个平板。而加有生防菌液的培养皿内牛津杯周围出现明显的透明抑菌圈，抑菌圈平均直径为25.92mm，见图1。

图1　菌株CZS对烟草野火病病原菌的拮抗作用Fig.1 Inhibitory activity of CZS strain on tobacco wildfire pathogenic bacteria

2.3菌株18对烟草角斑病病原菌的拮抗作用

通过室内平板拮抗作用实验对菌株18的拮抗作用进行测定，结果表明在培养3d后，对照组中角斑病菌生长旺盛，菌落布满整个平板。而加有生防菌液的培养皿内牛津杯周围出现明显的透明抑菌圈，抑菌圈平均直径为28.76mm，见图2。

图2　菌株CZS对烟草野火病病原菌的拮抗作用Fig.2 Inhibitory activity of CZS strain on tobacco wildfire pathogenic bacteria

2.4复合菌剂的拮抗作用

通过室内平板拮抗作用实验，对三种复合菌剂的抑菌效果进行测定。当生防细菌CZS的菌数为5.55× 109个/mL，生防细菌18的菌数为6.95×109个/mL时，从表1、表2可以得出，无论是针对烟草野火病菌还是角斑病菌，三种配比组合的抑菌效果均很明显，通过spss软件分析虽然三种组合的数值间不具有显著性差异（P＞0.05），但就抑菌能力来看，生防细菌CZS、18以2∶1配比而得的复合菌剂抑菌能力最强，因此最优比例为2∶1。

表1　不同配比的复合菌剂对野火病菌的抑菌作用（抑菌圈大小单位：mm）Tab.1 Bacteriostatic action of complex microbial inoculants in different proportion on wildfire pathogenic bacteria （inhibition zone size unit：mm）

表2　不同配比的复合菌剂对角斑病菌的抑菌作用（抑菌圈大小单位：mm）Tab.2 Bacteriostatic action of complex microbial inoculants in different proportion on angular leaf spot pathogenic bacteria （inhibition zone size unit：mm）

3　结论

生物防治作为烟草病害综合防治的重要组成部分，具有无污染、无公害、长效等优点，在可持续农业模式中占有十分重要的地位。本研究通过室内平板拮抗作用实验，分别对烟草细菌病害野火病与角斑病筛选到一株生防细菌。其中针对野火病的生防细菌经鉴定为枯草芽孢杆菌，角斑病的生防细菌经鉴定为甲基营养型芽孢杆菌。由于天气原因野火病与角斑病经常混合发生，病害流行年份可造成重大损失，但是能够同时抑制这两种病害的复合菌剂报道很少。本研究将两种生防细菌按不同比例进行混合，经过拮抗作用实验发现，生防细菌CZS、18以2∶1配比而得的复合菌剂具有最强的抑菌效果。

［1］ Lucas G B.Diseases of Tobacco（Third edition）［M］.Raieigh North Carolina，USA，1975.

［2］ 王玲玲，鲁燕泣，盛存波，等.烟草野火病土壤颉颃细菌的筛选和鉴定［J］.西北农业学报，2006，15（3）∶79-82.

［3］ 姜新，白建保，王左斌，等.烟草角斑病研究进展［J］.安徽农业科学，2007，35 （7）∶2014-2015.

［4］ 朱贤朝，王彦亭，王智发.中国烟草病害［M］.北京∶中国农业出版社，2002.

Screening of tobacco wildfire and angular leaf spot biocontrol strain

LIU Yu-shuai1，2，ZHANG Shu-mei1，2，CAO Xu1，2，HU Ji-hua1，2，JIANG Wei1，2，MENG Li-qiang1，2，CHEN Jing-yu1，2，LI Jing1，2
（1.Institute of Advanced Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150001，China；2.Institute of Microbiology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010，China）

In this study，we screened biocontrol strains which had good effect on tobacco bacterial diseases by laboratory plate antagonism test，and then studied their inhibitory activity and compound microbial agents.We screened a strain CZS which had inhibitory effect on tobacco wildfire disease which the average diameter of inhibition zone was 25.92mm，and a strain 18 which had inhibitory effect on Pseudomonas syringae pv.Tabaci which the average diameter of inhibition zone was 28.76mm.In addition，through the antibacterial test of compound microbial agents with different proportions indicated that compound microbial agent that CZS，18 were in a 2∶1 ratio had the most obvious inhibitory effect on this two kinds of bacterial diseases.

Tobacco bacterial diseases；Biocontrol strains；Screening；Inhibitory activity

S435.72

A

1674-8646（2016）12-0011-03

2016-05-06

刘宇帅（1988—），女，黑龙江哈尔滨人，硕士，助理研究员，从事农业微生物、分子生物学、生物防治方面研究。

李晶（1966—），黑龙江哈尔滨人，博士，研究员，硕士研究生导师，从事农业微生物、分子生物学、生物防治研究。