HPLC-ELSD法同时测定依托咪酯乳状注射液中磷脂酰胆碱与溶血磷脂酰胆碱

陈华，崔焕立，张雷，梁蔚阳Δ

(1.广东省药品检验所 生化药品室，广州 广东 510180；2中山大学新华学院 药学系，广州 广东 510520；3.华南理工大学 生物科学与工程学院，广东 广州 510060)

HPLC-ELSD法同时测定依托咪酯乳状注射液中磷脂酰胆碱与溶血磷脂酰胆碱

陈华1，崔焕立2，张雷3，梁蔚阳1Δ

(1.广东省药品检验所 生化药品室，广州 广东 510180；2中山大学新华学院 药学系，广州 广东 510520；3.华南理工大学 生物科学与工程学院，广东 广州 510060)

目的建立HPLC-ELSD法同时测定依托咪酯乳状注射液中磷脂酰胆碱(PC)与溶血凝血酰胆碱(LPC)含量。方法采用Lichrospher 100 Diol 125-4色谱柱 (100 mm×4.6 mm，5 um)，以正己烷-异丙醇-冰醋酸-三乙胺(814:170:15:0.8)为流动相A、异丙醇-水-冰醋酸-三乙胺(844:140:15:0.8)为流动相B，进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温55 ℃，蒸发光检测器检测温度为80 ℃。结果在选定的色谱条件下，磷脂酰胆碱在0.048～1.536 mg/mL范围内，溶血磷脂酰胆碱在0.0173～0.3118 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好。磷脂酰胆碱加样回收率为100.3%(RSD=1.4%)，溶血磷脂酰胆碱加样回收率为95.2%(RSD=2.4%)。结论HPLC-ELSD法准确、快捷、重复性好，可同时测定依托咪酯乳状注射液中磷脂酰胆碱与溶血凝血酰胆碱含量。

依托咪酯乳状注射液；磷脂酰胆碱；溶血磷脂酰胆碱；HPLC-ELSD

依托咪酯是一种全身麻醉药，性能独特，血流动力学变化和呼吸抑制较小，具有不同寻常的安全特性[1]。与丙泊酚相比较，在小儿手术中血流动力学稳定，具有苏醒时间短，麻醉效果好的优点[2]。老年人用药表明，可单独使用依托咪酯[3]或“丙泊酚+依托咪酯”麻醉诱导法，患者血压和心率变化较小，比单一使用丙泊酚更安全[4-5]。依托咪酯溶于水，但其水溶剂导致严重的注射痛，制备成中/长链脂肪乳注射液可显著减少注射痛和溶血的发生率[1,6]。依托咪酯乳状注射液是由依托咪酯、大豆油及中链甘油三酸脂经蛋黄卵磷脂乳化并加甘油制成的灭菌乳状液体，其质量控制要点与乳状注射液一致。

对于乳化剂蛋黄卵磷脂的质控，目前丙泊酚乳状注射液、脂肪乳注射液及中/长链脂肪乳注射液均测定磷的含量，即蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)等[7]成分中磷的总和。磷脂酰胆碱是蛋黄卵磷脂的主要组分，也是体现其功能的主要成分[8]，中国药典[9]规定蛋黄卵磷脂(供注射用)的磷脂酰胆碱含量不得小于68%。因此，仅仅测定磷的总量是不够的，有必要对磷脂酰胆碱含量进行测定。另外在制备、贮藏期间磷脂酰胆碱有可能降解产生溶血磷脂酰胆碱(LPC)，具有溶血或改变细胞渗透性等作用，故依托咪酯乳状注射液中溶血磷脂酰胆碱含量也需进行严格控制。本文旨在建立高效液相色谱法-蒸发光散射检测法同时测定依托咪酯乳状注射液中磷脂酰胆碱(PC)与溶血凝血酰胆碱(LPC)含量。

1 材料与方法

1.1.1 仪器：Agilent 1200 Series高效液相色谱仪(美国安捷伦)；Alltech 3300蒸发光散射检测器(美国奥泰)；Sartarius CPA225D电子天平(德国赛多利斯)。

1.1.2 药品与试剂：依托咪酯乳状注射液(生产企业A，批号14255034、14235034、14244035)。磷脂酰胆碱对照品(批号：SLBH3672V ，含量99%)；溶血磷脂酰胆碱对照品(批号：SLBJ4793V，含量99%)；磷脂酰乙醇胺(批号：SLBN7096V，含量99%)，均购自Sigma公司；正己烷、异丙醇、冰醋酸和三乙胺均为色谱纯；水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件：色谱柱： Lichrospher 100 Diol 125-4(100 mm×4.6 mm，5 um)；以：正己烷-异丙醇-冰醋酸-三乙胺(814:170:15:0.8)为流动相A，异丙醇-水-冰醋酸-三乙胺(844:140:15:0.8)为流动相B；柱温为55 ℃：漂移管温度80 ℃。按下列梯度洗脱：

时间(min)B(%)流速(mL/min)005105020108540101501001017510010176510210510220520270520290510

1.2.2 溶液的制备

① 供试品溶液：精密量取本品1 mL，置10 mL量瓶中，用二氧六环溶解并稀释至刻度，摇匀。

② 对照品溶液：取磷脂酰胆碱对照品24 mg，精密称定，置5 mL量瓶中，加正己烷-异丙醇(1:1)适量，超声使溶解，并稀释至刻度，混匀，作为磷脂酰胆碱对照品储备液。取磷脂酰乙醇胺对照品10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加正己烷-异丙醇(1:1)适量，超声使溶解，并稀释至刻度，混匀，作为磷脂酰乙醇胺对照品储备液。取溶血磷脂酰胆碱对照品20 mg，置25 mL量瓶中，加正己烷-异丙醇(1:1)适量，超声使溶解，并稀释至刻度，作为溶血磷脂酰胆碱对照品储备液。分别精密量取磷脂酰胆碱对照品储备液适量，用正己烷-异丙醇-二氧六环(10:10:80)稀释制成每1 mL中约含磷脂酰胆碱0.048、0.288、0.864、1.152、1.536 mg的溶液，作为磷脂酰胆碱对照品溶液。另分别精密量取溶血磷脂酰胆碱对照品储备液适量，用正己烷-异丙醇-二氧六环(10:10:80)稀释制成每1 mL中约含溶血磷脂酰胆碱0.016、0.08、0.16、0.192、0.288 mg的溶液，作为溶血磷脂酰胆碱对照品溶液。

从大赛的实施过程可以很明显的看出，大赛不仅为学生提供了一个很好的实践平台，一个展示自我的平台，极大地提高了学生的创新意识、实践能力和团队协作能力[6]。

③ 系统适用性溶液：精密量取磷脂酰胆碱对照品储备液0.16 mL、磷脂酰乙醇胺对照品储备液0.25 mL和溶血磷脂酰胆碱对照品储备液0.5 mL，用正己烷-异丙醇-二氧六环(10:10:80)稀释至2 mL( 每1 m中约含磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰胆碱分别为1.2 mg、0.25、0.19 mg的溶液)。

精密量取供试品溶液和磷脂酰胆碱系列对照品溶液各10 μL，另精密量取系统适用性溶液、供试品溶液和溶血磷脂酰胆碱系列对照品溶液各20 μL，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定。以对照品系列溶液的浓度与相应的峰面积计算二次回归方程。

1.2.3 方法学验证

① 线性试验：分别精密量取“1.2.2”项下的磷脂酰胆碱系列对照品溶液10 μL与溶血磷脂酰胆碱系列对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照品溶液的浓度与相应的峰面积计算二次回归方程。

② 重复性试验：取同一批次的依托咪酯乳状注射液(批号：14255034)，精密量取1 mL供试品，共6份，按“1.2.2”方法分别制备供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定。

③ 检测限：取“1.2.2”项下磷脂酰胆碱对照品溶液与溶血磷脂酰胆碱对照品溶液，逐步用正己烷-异丙醇-二氧六环(10:10:80)稀释至色谱图中磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱峰高为噪音的3倍，为检测限。

④ 定量限：取“1.2.2”项下磷脂酰胆碱对照品溶液与溶血磷脂酰胆碱对照品溶液，用正己烷-异丙醇-二氧六环(10:10:80)稀释至色谱图中磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱峰高为噪音的10倍，为定量限。

⑤ 回收率：试验取样品(批号14244035)0.5 mL，分别加入“1.2.2”项下磷脂酰胆碱对照品储备液和溶血磷脂酰胆碱储备液各0.4、0.5、0.6 mL，加正己烷-异丙醇-二氧六环(10:10:80)稀释至10 mL，制成80%、100%和120%的低、中、高浓度的溶液，每个浓度平行3份。按“1.2.1”项下色谱条件进行测定。

⑥ 样品测定：按“1.2.2”项下供试品溶液的配制方法制备，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定。以峰面积计算磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱的含量。

2 结果

2.1 系统适应性试验 磷脂酰乙醇胺与磷脂酰胆碱分离度为2.5，磷脂酰胆碱与溶血磷脂酰胆碱分离度为10.7。见图1。

图1 各溶液HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of each solution

2.2 线性试验 以各组分浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，计算二次回归方程。磷脂酰胆碱与溶血磷脂酰胆碱的二项式回归方程分别为：Y=-3452X2+35733X-2422.3，r=1.0；Y=37027X2+22241X-132.47，r=1.0。结果表明磷脂酰胆碱在0.048～1.536 mg/mL,溶血磷脂酰胆碱在0.0173～0.3118 mg/mL,线性关系良好。

2.3 重复性试验 测得磷脂酰胆碱平均含量为9.4 mg/mL，RSD值为1.3%；溶血磷脂酰胆碱平均含量为0.6 mg/mL，RSD值为2.5%。

2.4 检测限 磷脂酰胆碱检测限为0.11 μg、溶血磷脂酰胆碱检测限为0.17 μg。

2.5 定量限 磷脂酰胆碱定量限为 0.35 μg、溶血磷脂酰胆碱定量限为 0.35 μg。

2.6 回收试验 磷脂酰胆碱平均回收率为100.3%，RSD值为1.4%；溶血磷脂酰胆碱平均回收率为95.2%，RSD值为2.4%。结果表明该方法有良好的回收率。见表1。

表1 回收率计算结果(n=9)Tab.1 Results of recovery test(n=9)

2.7 样品测定结果 样品测定结果见表2。

表2 样品测定结果

3 讨论

依托咪酯乳状注射液处方中蛋黄卵磷脂为12 mg/mL，本法测得样品中磷脂酰胆碱约为10 mg/mL，即蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱的含量约为83%，符合中国药典蛋黄卵磷脂(供注射用)的规定(磷脂酰胆碱不得少于68%)。

样品中磷脂酰胆碱(主成分)和溶血磷脂酰胆碱(杂质))含量相差较大，信号响应相差也较大，所以检测磷脂酰胆碱时进样量为10 μL，检测溶血磷脂酰胆碱时进样量为20 μL。

由系统适用性试验可见，磷脂酰胆碱乙醇胺、磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱分离度良好，但测定依托咪酯乳状注射液时，磷脂酰胆碱乙醇胺与辅料峰不能很好分离。因此，本方法未能测定磷脂酰乙醇胺。

[1] 陈熹，刘鲲鹏，李成辉.依托咪酯的临床及分子药理学新进展[J].中日友好医院学报，2016，30(1)：40-43.

[2] 脏剑蔚，白洁.丙泊酚与依托咪酯在儿科麻醉中的诱导和苏醒效果比较[J].医学综述，2016，22(13)：2672-2675.

[3] 冯超男，徐志华，高玉福.依托咪酯丙泊酚在老年患者腹腔镜胆囊切除术中的应用比较[J].医学理论与实践，2016，29(10)：1335-1336.

[4] 朱成玉.老年人麻醉中丙泊酚与依托咪酯诱导的效果分析[J]，中国老年保健医学,2016，14(3)：45-47.

[5] 刘晔.老年患者实施丙泊酚联合依托咪酯的诱导作用[J].临床研究，2016，14(17)：78-80.

[6] Nyman Y,Hofsten K,Palm C,et al.Etomidatelipero is assosated with considerably less injection pain in children compared with propofol with added lidocaine[J].Br J Anaesth,2006,97:536-539.

[7] 陈闯，王思玲，苏德森.磷脂药物制剂研究进展[J].中国生化药物杂志，2003，24(2):98-101.

[8] 徐明明，吕晶，方欣欣，等.蛋黄卵磷脂和蛋黄磷脂酰胆碱的组成与结构分析[J].中国药师，2014，17(10)：1669-1672.

[9] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部)[M].北京，中国医药科技出版社，2015:578-580.

(编校：吴茜)

作者简介

梁蔚阳，广东省药品检验所生化药品室主任，主任药师。长期从事生化药品及生物制品质量控制及研究工作，完成大量生化药品和生物制品标准起草复核工作，发表学术论文数十篇。现为国家药品GMP检查员、中国生化制药工业协会专家、《中国生化药物杂志》编委、广东省第三届突发事件应急管理专家库专家、广东省药品GMP检查员、广东省技术监督局实验室资质认定评审员、广东省预防接种异常反应调查诊断专家组成员。

SimultaneousdeterminationofphophatidylcholineandlysophophatidylcholineinEtomidateInjectableEmulsionbyHPLC-ELSD

CHEN Hua1, CUI Huan-li2, ZHANG Lei3, LIANG Wei-yang1Δ
(1.Biochemical Laboratory, Guangdong Institute for Drug Control, Guangzhou 510180, China; 2.Xinhua College of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510520, China; 3.School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510060, China)

ObjectiveTo develop an HPLC-ELSD method for simultaneous determination of phosphatidylcholine (PC) and lysophosphatidyl choline (LPC) in Etomidate Injectable Emulsion.MethodsSeparation was carried out on a Lichrospher 100 Diol 125-4 culumn(100 mm×4.6 mm，5um),The gradient elution mobile phase consisted of two eluents: n-hexane-isopropanol-glacial acetic acid-triethylamine(814:170:15:0.8)as mobile phase A, isopropanol-water-glacial acetic acid-triethylamine(844:140:15:0.8)as mobile phase B.The flow rate was 1.0 mL/min at a temperature of 55 ℃.The detector was ELSD of which the drift tude temperature was maintained at 80 ℃.ResultsThe linear ranges of phosphatidyl choline of calibration curve was 0.048-1.536 mg/mL,andthe linear ranges of lysophosphatidylcholineof calibration curve was 0.0173-0.3118 mg/mL.The average recovery of phosphatidyl choline was 100.3%(RSD=1.4%),and the average recovery of lysophosphatidylcholinewas95.2%(RSD=2.4%).ConclusionThe mothod is simple,accurate and reproducible for determination of phosphatidylcholine andlysophosphatidyl choline in Etomidate Injectable Emulsion.

Etomidate Injectable Emulsion; phosphatidylcholine; lysophosphatidylcholine; HPLC-ELSD

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.10.004

广东省食品药品检验检测技术创新专项资金项目(2015ZX05)；广东省医学科研基金项目(A2015256)；广东省科技计划项目(2016A010121004)

陈华，女，硕士，副主任药师，研究方向：生化药品质量控制和标准研究，E-mail：gdchenhua@sina.com；梁蔚阳，通信作者，女，硕士，主任药师，研究方向：生化药品质量控制和标准研究，E-mail：lwy-123@163.com。

R927

A