EBV抗体和EBV-DNA在鼻咽癌诊断及分期的研究*

俞霞　季明芳　程伟民　黄玉玲　李付贵

EBV抗体和EBV-DNA在鼻咽癌诊断及分期的研究*

俞霞季明芳程伟民黄玉玲李付贵

目的：评估EBNA1/IgA、Zta/IgA、VCA/IgA和EBV-DNA对不同分期鼻咽癌的诊断效能，探讨各指标阳性率与鼻咽癌分期的关系。方法：收集2010年3月至2015年9月中山大学附属中山医院收治的初诊鼻咽癌患者152例，健康体检者675例。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清EBNA1/IgA、Zta/IgA和VCA/IgA抗体ROD值，荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，FQPCR）检测血浆EBV-DNA水平。比较单独和联合应用EBV标记物对各期鼻咽癌的诊断效能，同时分析各指标阳性率与鼻咽癌分期的关系。结果：鼻咽癌患者EBNA1/IgA、Zta/IgA、VCA/IgA和EBV-DNA阳性率显著高于健康体检者（P＜0.01）。EBNA1/IgA在早期鼻咽癌表达相对较高，灵敏度为77.8%，而EBV-DNA在晚期鼻咽癌的灵敏度最高为88.8%，两者特异度均在96%以上。联合检测中EBNA1/IgA并联EBV-DNA检测的灵敏度为92.1%（早期为82.5%、晚期为98.9%），特异度为96.9%。EBV-DNA阳性率与鼻咽癌临床分期和N分期呈正相关，Zta/IgA阳性率与N分期呈正相关（P＜0.01）。结论：在无症状人群中进行鼻咽癌筛查，单项指标首选EBNA1/IgA。晚期患者的辅助诊断则推荐EBV-DNA。两者并联检测可进一步提高鼻咽癌诊断效能。EBV-DNA是鼻咽癌分期和病情监测的重要指标，Zta/IgA可间接反映淋巴结转移情况，有望对患者病情评估起到参考作用。

鼻咽癌EBV抗体EBV-DNA诊断分期

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）的持续感染与鼻咽癌密切相关［1］。早在20世纪90年代末就有研究者提出利用EBV特异性IgA抗体和EBV-DNA诊断鼻咽癌的设想［2-3］。然而，有关EBV标记物在鼻咽癌诊断和分期的研究仍存有争议，且相关研究多局限于晚期患者。本研究在鼻咽癌高发地区广东省中山市收集大量各期鼻咽癌患者，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清EBNA1/IgA、Zta/IgA和VCA/IgA抗体ROD值，荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR）检测血浆EBV-DNA水平，系统评价上述指标在各期鼻咽癌中的诊断价值及与分期的关系。

1　材料与方法

1.1研究对象

鼻咽癌组为2010年3月至2015年9月在中山大学附属中山医院收治的初诊鼻咽癌患者152例，所有患者均经鼻咽活检病理确诊，病理类型以未分化非角化性癌为主占98.7%（150/152）。鼻咽癌分期按2008年福州分期标准。健康对照组为在中山大学附属中山医院行体检的健康人群675例。

1.2方法

1.2.1血清EBV抗体检测检测EBNA1/IgA、Zta/ IgA和VCA/IgA的试剂盒均由中山生物工程有限公司提供。根据ELISA试剂盒的操作规程，检测EBV抗体ROD值，ROD≥1.000为阳性。

1.2.2 血浆EBV-DNA检测血浆EBV-DNA的提取采用QIAmp DNA Blood Mini kit试剂盒（购自德国Qiagen公司）。FQ-PCR扩增体系所用试剂采用2×TaqMan Universal PCR Master Mix试剂盒（购自广州英韦创津生物科技有限公司）。探针和引物由中国香港TECH DRAGON LTD公司合成；采用ABI7900型FQ-PCR仪进行扩增，计算EBV拷贝数，DNA水平＞100 copies/mL为阳性，具体过程参见参考文献［4］。

1.2.3相关定义及计算灵敏度=a/（a+b）；特异度= d/（c+d）。其中a为检测呈阳性结果的鼻咽癌患者例数，b为呈阴性结果的鼻咽癌患者例数，c为检测呈阳性结果的健康人群例数，d为呈阴性结果的健康人群例数。

1.3统计学分析

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计数资料用百分数表示，组间阳性率的比较采用χ2检验。采用ROC曲线评价各指标对鼻咽癌诊断的效能。等级资料组间相关关系应用Spearman秩相关检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1鼻咽癌组和健康对照组一般资料及临床资料分析

鼻咽癌组152例，男女比例为2.17：1，平均年龄为（48.75±7.13）岁。健康对照组675例，男女比例为1.5 4：1，平均年龄为（44.87±7.65）岁。两组性别、年龄差异均无统计学意义（χ2=3.228，P=0.072，P＞0.05；Z= 3.065，P=0.054，P＞0.05，表1）。

2.2鼻咽癌组和健康对照组EBV抗体和EBV-DNA阳性率比较

鼻咽癌组患者中EBNA1/IgA、Zta/IgA、VCA/IgA 和EBV-DNA阳性率分别显著高于健康对照组的各指标阳性率（P＜0.01，表2）。

表1　两组人群一般资料和临床资料分析Table 1　Clinical features and characteristics at baseline of two groups

表2　两组人群EBV相关指标阳性率的比较Table 2　Comparison of positive rates for EBV in two groups

2.3EBV标记物单项指标检测对鼻咽癌诊断效能的比较

以鼻咽癌组和健康对照组为研究对象，采用ROC曲线（图1）。EBV-DNA的ROC曲线下面积为0.902（95% CI为0.865～0.940）；EBNA1/IgA的ROC曲线下面积为0.879（95%CI为0.840～0.918）；Zta/IgA的ROC曲线下面积为0.773（95%CI为0.724～0.823）；VCA/IgA的ROC曲线下面积为0.682（95%CI为0.629～0.735）。单项指标检测，EBV-DNA和EBNA1/IgA诊断鼻咽癌灵敏度约为80%，特异度在96%以上。对鼻咽癌进一步分期显示，在早期（Ⅰ期+Ⅱ期）鼻咽癌中，EBNA1/IgA的灵敏度和特异度分别为77.8%和96.9%，诊断效能相对较高。而在晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）鼻咽癌中，EBV-DNA的灵敏度和特异度分别为88.8%和99.6%，故单项指标检测推荐EBV-DNA。

2.4EBV标记物联合检测对鼻咽癌诊断效能的比较

EBV标记物联合检测方案中，“串联”规则表示联合检测的几个指标同时为阳性，则定位阳性，有1个为阴性则定位阴性。“并联”规则表示联合检测的几个指标有1个为阳性就定位阳性，全部阴性就定位阴性。在串联各组合中，特异度均约为99.0%，但灵敏度欠佳。其中EBNA1/IgA串联EBV-DNA，灵敏度最高为65.9%。Zta/IgA串联EBV-DNA，灵敏度次之为50.7%。4个指标串联检测，灵敏度最差为20.4%。在并联组合中，最佳方案为EBNA1/IgA并联EBV-DNA，其灵敏度为92.1%（早期为82.5%、晚期为98.9%），特异度为96.9%。在此基础上增加Zta/IgA检测，其灵敏度进一步提高至96.1%，但特异度下降为92.9%，为鼻咽癌诊断的候选方案。4个指标并联检测，其特异度最差为85.8%。

2.5EBV标记物阳性率与鼻咽癌分期的关系

图1EBNA1/IgA、Zta/IgA、VCA/IgA和EBV-DNA的ROC曲线Figure 1　The ROC curve of EBNA1/IgA，Zta/IgA，VCA/IgA，and EBV-DNA

EBNA1/IgA、Zta/IgA、VCA/IgA和EBV-DNA阳性率在各T分期间差异均无统计学意义（P＞0.05）。在N分期中Zta/IgA和EBV-DNA阳性率在各期间差异均具有统计学意义（P＜0.05），随着N分期的升高，Zta/IgA和EBV-DNA阳性率呈上升趋势（P＜0.01），Spearson秩相关系数分别为0.264和0.324。在鼻咽癌临床分期中，EBV-DNA阳性率在各期间差异均具有统计学意义（P＜0.01），随着临床分期的升高，EBV-DNA阳性率呈上升趋势（P＜0.01），Spearson秩相关系数为0.468，见表3。

表3　EBV抗体和EBV-DNA阳性率与鼻咽癌分期的关系Table 3　Relationship between stages of NPC and positive rates of EBV antibodies and EBV-DNA

3　讨论

EBV在鼻咽癌诊断及分期的应用研究的相关报道多局限于晚期鼻咽癌病例，而EBV标记物种类及检测方法学不断更新［5-7］。因此，本研究在鼻咽癌高发地区广东省中山市收集大量各期鼻咽癌患者，选用ELISA法检测EBV各时相表达的IgA类抗原（EBNA1、Zta和VCA），FQ-PCR检测血浆EBV-DNA，系统评估上述指标在各期鼻咽癌中的诊断价值及与分期的关系。

本研究鼻咽癌组EBNA1/IgA、Zta/IgA、VCA/IgA 和EBV-DNA阳性率显著高于健康对照组。其中EBV-DNA和EBNA1/IgA的ROC曲线下面积约为0.9，诊断价值较高，Zta/IgA次之，VCA/IgA最差。进一步分析显示，不同分期鼻咽癌中各指标诊断效能不同。EBNA1/IgA在早期鼻咽癌中灵敏度最高为77.8%，而晚期鼻咽癌中EBV-DNA灵敏度最高为88.8%，两者特异度均在96%以上。有研究报道，EBV标记物诊断鼻咽癌效能各有差异，考虑不仅与检测方法、试剂厂家不同有关外，还与鼻咽癌分期选择偏倚有关［8-10］。EBNA1是唯一在EBV潜伏感染和活化状态中均表达的蛋白，在鼻咽癌癌变前即可检测出，有望成为鼻咽癌筛查的理想指标［11-12］。而EBV-DNA在晚期鼻咽癌中敏感度很高，缺点是在Ⅰ期鼻咽癌中假阴性率较高［13-14］。本研究结论也支持上述观点。在无症状人群中进行鼻咽癌筛查，单项指标检测首选EBNA1/IgA。晚期患者的辅助诊断则推荐EBV-DNA。

EBV标记物联合检测方案中，最佳组合为EBNA1/IgA并联EBV-DNA检测。进一步提高单项指标检测的准确性，灵敏度为92.1%（早期为82.5%、晚期为98.9%），特异度为96.9%。不仅减少临床漏诊的概率，而且控制特异度为96.9%是较理想的水平，为EBV标记物联合检测诊断鼻咽癌的首选方案。而在此基础上增加Zta/IgA检测，在增加诊断成本的同时，虽然灵敏度进一步提高至96.1%，但特异度下降为92.9%，为鼻咽癌诊断的候选方案。

本研究结果还显示EBV-DNA阳性率与鼻咽癌N分期和临床分期有关，伴随分期的升高，EBV-DNA阳性率呈上升趋势，这与Ji等［4］研究结论一致。说明EBV-DNA水平与鼻咽癌患者颈部淋巴结转移和体内肿瘤负荷呈正相关。在EBV血清学检测中，EBNA1/IgA和VCA/IgA阳性率在各分期间差异均无统计学意义，仅Zta/IgA阳性率与N分期呈正相关。与蔡永林等［15］研究结论不相符，而与罗耀凌等［16］报道类似。Zta/IgA表达表明EBV已被激活进入溶解性感染期，随着淋巴结转移范围的扩大，抗体水平也相应增多。EBV-DNA反映体内肿瘤负荷，可作为鼻咽癌病情监测的重要指标。血清Zta/IgA检测可间接反映淋巴结转移情况，是否对鼻咽癌病情评估起到一定提示意义有待于进一步研究证实。

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（2016-04-06收稿）

（2016-07-04修回）

（编辑：孙喜佳校对：杨红欣）

Assessment of EBV antibodies and EBV-DNA in the diagnosis and stages of nasopharyngeal carcinoma

Xia YU，Mingfang JI，Weimin CHENG，Yuling HUANG，Fugui LI
Correspondence to：Mingfang JI，E-mail：jmftbh@sina.com
Cancer Research Institution of Zhongshan，Zhongshan Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Zhongshan 528400，China This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81572062）

Objective：To evaluate the efficacy of Epstein-Barr nuclear antigen 1/immunoglobulin A（EBNA1/IgA），BamH1 Z transactivator/ IgA（Zta/IgA），capsid antigen/IgA（VCA/IgA），and Epstein-Barr virus deoxyribonucleic acid（EBV-DNA）in detecting different stages of nasopharyngeal carcinoma（NPC）.The relationship between the EBV markers and stages of NPC was also analyzed.Methods：Blood samples of 152 untreated patients with NPC and 675 healthy subjects were collected.ELISA was used to detect the serum levels of EBNA1/ IgA，Zta/IgA，and VCA/IgA.Fluorescence quantitative PCR（FQ-PCR）was used to detect the plasma levels of EBV-DNA.ROC and correlation analyses were employed to assess the detection assays for NPC diagnosis.The positive rates of EBV markers in NPC patients in different stages were analyzed statistically.Results：The positive rates of EBNA1/IgA，Zta/IgA，VCA/IgA，and EBV-DNA in NPC patients were higher than those in the healthy individuals.The expression of EBNA1/IgA was relatively high in early NPC.The sensitivity of EBNA1/IgA was 77.8%.In advanced NPC，the level of EBV-DNA was high，and the sensitivity of EBV-DNA was 88.8%.The specificity of EBV-DNA and EBNA1/IgA could reach more than 96%.The combination of EBV-DNA and EBNA1/IgA showed the best diagnostic value，with a sensitivity of 92.1%（early stage 82.5%，advanced stage 98.9%）and a specificity of 96.9%.The positive rates of EBV-DNA were positively associated with the NPC clinic stage and N stage.The positives rates of Zta/IgA were positively associated with the NPC N stage.Conclusion：The best single index for NPC screening in an asymptomatic population is EBNA1/IgA.EBV-DNA is an ideal index for auxiliary diagnostics of advanced NPC.The combination of EBV-DNA and EBNA1/IgA shows the best diagnostic value.EBV-DNA is an important index in the stage and illness monitoring of NPC.Zta/IgA can indirectly reflect the character of lymph node metastasis，and it may be useful in assessment of NPC surveillance.

nasopharyngeal carcinoma，EBV antibody，EBV-DNA，diagnosis，stage

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.15.393

中山大学附属中山医院，中山市肿瘤研究所（广东省中山市528400）

*本文课题受国家自然科学基金项目（编号：81572062）资助

季明芳jmftbh@sina.com

俞霞专业方向为恶性肿瘤的早诊早治。E-mail：houls666@163.com