不同产地酿酒葡萄“赤霞珠”果实中有机酸差异性研究

赵　悦,韩　宁,孙玉霞,孙庆扬,韩爱芹,赵新节,*

(1.齐鲁工业大学生物工程学院,山东济南 250353;2.山东省农业科学院农产品研究所,山东济南 250100)



不同产地酿酒葡萄“赤霞珠”果实中有机酸差异性研究

赵悦1,韩宁1,孙玉霞2,孙庆扬1,韩爱芹1,赵新节1,*

(1.齐鲁工业大学生物工程学院,山东济南 250353;2.山东省农业科学院农产品研究所,山东济南 250100)

采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC),对云南迪庆德钦、河北怀来沙城和山东烟台莱山三地的成熟期酿酒葡萄“赤霞珠”果实中6种主要有机酸的含量进行差异性分析。结果表明,不同产地的酿酒葡萄果肉和果皮中有机酸总量存在明显差异(p<0.05)。三产地酿酒葡萄果肉中有机酸含量以云南迪庆德钦11.434 mg/g·FW为最高,而酿酒葡萄果皮中有机酸含量最高的是山东烟台莱山19.081 mg/g·FW。6种主要有机酸在不同产地酿酒葡萄果肉和果皮中含量均不同,其中酒石酸与L-苹果酸共占葡萄果肉和果皮中有机酸总量的86.5%和77.0%以上,共同构成了酿酒葡萄果肉和果皮中最主要的有机酸。另外,不同产地的酿酒葡萄果皮中酒石酸、L-苹果酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸的含量均高于果肉。除山东烟台莱山,其它两产地酿酒葡萄果肉中草酸含量高于果皮。总之,酿酒葡萄“赤霞珠”果实中有机酸的分布存在组织特异性,并且其含量与产地的气候密切相关。

产地,酿酒葡萄,有机酸

有机酸是酿酒葡萄果实中主要的风味物质之一,也是评价酿酒葡萄与葡萄酒品质的重要指标[1]。在成熟的葡萄果实中,有近70%的有机酸分布在果皮和果肉中,而在种子中的含量很少[2]。其中含量最多的是酒石酸和L-苹果酸,这两者共占有机酸总含量的90%以上[3],此外,还含有少量的草酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸等。酒石酸是葡萄果实中的特征酸,是葡萄与葡萄酒中酸度的主要来源;L-苹果酸是一种具有强烈辛酸味的双羧基酸,当其在葡萄中含量较高时,酿造出来的葡萄酒会给人以酸涩和粗糙的感觉,但在发酵结束后,L-苹果酸可在乳酸菌的作用下分解为乳酸[2]。这些有机酸不仅为葡萄酒提供了骨架物质[4],参与葡萄酒味感的平衡,还决定了葡萄酒的pH[5]和缓冲能力[6],进而影响了葡萄酒的微生物稳定性、颜色稳定性和陈酿潜力[7-9]。

表1　葡萄园地址、生态条件及栽培模式

关于有机酸检常见的分析检测方法有电位滴定法[10]、分光光度法[11]、酶法[12]、薄层色谱法[13]、气相色谱法[14]液相色谱法[15]、离子色谱法[16]和毛细管电泳法[17]等。其中反相高效液相色谱法(RP-HPLC)因其具有操作简单、准确度高、重现性好等优点,而且可以同时测定样品中的多种有机酸,目前有着广泛的应用[18]。

本文采用RP-HPLC法,对云南迪庆德钦、河北怀来沙城和山东烟台莱山三地的成熟期酿酒葡萄“赤霞珠”果肉和果皮中的有机酸进行差异性分析,以期为酿酒葡萄选择最佳的栽培地区以及我国葡萄酒地方特色的形成提供依据。

1　材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

1.1.1材料实验所用的酿酒葡萄“赤霞珠”果实样品于2014年9月下旬至10月下旬手工采摘,从葡萄园中不同方位随机手工采摘健康、成熟的葡萄果实400～500粒,采摘后置于保温冰箱中带回实验室立即进行液氮速冻,置于-80 ℃低温冰箱保存备用,葡萄果实长途运输过程中采用干冰保藏。葡萄园地址、生态条件及栽培模式见表1。

1.1.2试剂草酸、酒石酸、L-苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸、葡萄糖和果糖标准样品色谱纯,美国Sigma公司;磷酸分析纯,天津市森达化工产品销售有限公司;磷酸二氢钾分析纯,天津市风船化学试剂科技有限公司。氢氧化钠分析纯,天津市北方天医化学试剂厂;乙腈色谱纯,美国TEDIA有限公司。

1.1.3仪器高效液相色谱仪LC-20A,日本岛津公司;高速冷冻离心机Neofuge 15R,上海力申科学仪器有限公司;pH计PB-10,德国赛多利斯股份公司;电子分析天平BS124S,德国赛多利斯股份公司;超低温冷冻储存箱DW-HW50,中科美菱低温科技有限责任公司;超声波清洗机SB-5200D,宁波新芝生物科技股份有限公司;自动双重纯水蒸馏器SZ-93,上海亚荣生化仪器厂;旋转蒸发仪RE52CS,上海亚荣生化仪器厂。

1.2方法

1.2.1百粒重测定方法随机选取100粒果实,用分析天平准确称重(精确至0.01 g)。

1.2.2可溶性固形物测定方法果实榨汁后用手持折光仪测定。

1.2.3pH测定方法取30 mL葡萄汁于50 mL烧杯中,用已校正的pH计测定。

1.2.4总酸测定方法采用电位滴定法(GB/T 15038-2006)测定。

1.2.5可溶性糖测定方法

1.2.5.1色谱条件色谱柱:Agilent ZORBAX NH2(250×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈∶水=75∶25(v/v);流速:1.0 mL/min;进样量:10 μL;柱温:40 ℃;检测器:示差检测器;分析时间:20 min。

1.2.5.2可溶性糖标准溶液配制准确称取葡萄糖和果糖各1.000 g于10 mL容量瓶中,用纯水溶解并定容,得到100.000 g/L可溶性糖混合标准溶液,依次用纯水稀释配成50.000 g/L、40.000 g/L、20.000 g/L、和10.000 g/L的可溶性糖混合标准溶液,用0.45 μm滤膜过滤于样品瓶中,置于-20 ℃备用。

表2　不同产地酿酒葡萄“赤霞珠”果实基本理化指标

注:数字后不同小写字母表示差异达到显著水平p<0.05。

1.2.5.3样品制备随机选取葡萄果实样品,将葡萄果实样品在液氮保护下剥去果皮、去籽,果肉加液氮磨成粉末,准确称取3.000 g样品于15 mL离心管中,加入80%的乙醇溶液6.0 mL,在35 ℃条件下超声波震荡提取20 min,之后在8000 r/min、20 ℃条件下离心10 min,取上层清液,重复提取3次,合并上清液于35 ℃减压浓缩,最后定容至10 mL,用0.45 μm滤膜过滤后进行测定。

1.2.6有机酸测定方法

1.2.6.1色谱条件色谱柱:Thermo Hypersil GOLD aQ(250×4.6 mm,5μm);流动相:0.01 mol/L KH2PO4(pH=2.2);流速:0.5 mL/min;进样量:10 μL;柱温:25 ℃;检测波长:210 nm,分析时间:30 min。

1.2.6.2有机酸标准溶液配制准确称取草酸、酒石酸、L-苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸0.200 g于10 mL容量瓶中,用流动相溶解并定容,摇匀备用,准确吸取上述6种有机酸溶液1.00 mL于10 mL容量瓶中,用流动相定容,得到2.000 g/L有机酸混合标准溶液,依次用流动相稀释配成1.000、0.500、0.250、0.125 g/L的有机酸混合标准溶液,用0.45 μm滤膜过滤于样品瓶中,置于-20 ℃备用。

1.2.6.3样品制备随机选取葡萄果实样品,将葡萄果实样品在液氮保护下剥去果皮、去籽,果肉、果皮分别研磨成粉末,准确称取1.000 g样品于25 mL离心管中,加入8 mmol/L的磷酸提取液10 mL,在25 ℃条件下超声波震荡提取10 min,之后在8000 r/min、4 ℃条件下离心20 min,取上层清液,用0.45 μm滤膜过滤后进行测定。

1.3数据统计与分析

每个样品重复3次。数据整理与分析采用EXCLE 2007和SPSS Statistics 19软件。

2　结果与分析

2.1不同产地的酿酒葡萄“赤霞珠”果实基本理化指标

不同产地酿酒葡萄“赤霞珠”果实百粒重、可溶性糖、可溶性固形物(TSS)、pH与总酸含量等基本理化指标及其差异性见表2,结果显示三产地酿酒葡萄“赤霞珠”果实百粒重之间存在显著性差异,具体表现为山东烟台莱山>河北怀来沙城>云南迪庆德钦。此外云南德钦葡萄果实中葡萄糖含量为102.41 mg/g·FW,明显高于河北沙城的99.44 mg/g·FW和山东莱山的100.07 mg/g·FW,并且与TSS之间的差异性相一致,但果糖含量彼此之间的差异并不大。同时三产地葡萄果实总酸含量之间也存在显著性差异,并在云南德钦产地的葡萄果实中最高,其含量为5.02 g/L(以酒石酸计),较河北沙城和山东莱山分别高0.21 g/L和0.89 g/L。并且果实pH与果实总酸含量相符。

2.2有机酸标准曲线绘制

按照方法1.2.6.1的色谱条件,6种有机酸的分离效果较好,结果如图1所示。以各标准有机酸质量浓度X对峰面积Y进行线性回归,得到6种有机酸标准品的回归方程和相关系数,结果如表3所示。

表3　标准有机酸峰面积回归分析

注:回归方程中Y为峰面积,X为浓度。

图1　6种标准有机酸HPLC色谱图Fig.1　HPLC chromatogram of six organic acid standards

2.3不同产地酿酒葡萄“赤霞珠”果肉中有机酸含量

采用RP-HPLC法分别对不同产地酿酒葡萄“赤霞珠”果肉中6种有机酸进行分析,并根据外标法进行定量计算,结果如表4所示。结果表明,三产地酿酒葡萄“赤霞珠”果肉样品中均检测出草酸、酒石酸、L-苹果酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸。其中酒石酸和L-苹果酸含量共占有机酸总量的86.5%以上,构成了葡萄果肉中主要的有机酸;而草酸、琥珀酸含量相对较少,其含量均低于0.3 mg/g·FW。果肉中所测定的6种有机酸在有机酸总量中所占比例表现为酒石酸>L-苹果酸>乳酸>琥珀酸>草酸>柠檬酸。由表4可以看出,三产地酿酒葡萄“赤霞珠”果肉有机酸总量之间均存在显著差异,葡萄果肉中有机酸总量以云南迪庆德钦11.434 mg/g·FW为最高,这主要体现在其果肉6种有机酸中的4种(酒石酸、L-苹果酸、柠檬酸、琥珀酸)均显著高于河北怀来沙城和山东烟台莱山,尤其是对有机酸总量贡献较大的酒石酸和L-苹果酸,其含量分别为7.800 mg/g·FW和2.088 mg/g·FW。河北怀来沙城和山东烟台莱山果肉中酒石酸、柠檬酸和琥珀酸含量之间并无显著性差,其差异主要表现在草酸、L-苹果酸和乳酸的含量上。河北怀来沙城葡萄果肉中L-苹果酸和乳酸含量分别为1.890 mg/g·FW和0.781 mg/g·FW,显著高于山东烟台莱山的1.162 mg/g·FW和0.538 mg/g·FW,而河北怀来沙城葡萄果肉中草酸含量为0.208 mg/g·FW略低于山东烟台莱山的0.225 mg/g·FW,但在葡萄果肉有机酸总量上河北怀来沙城仍高于山东烟台莱山。

表4　不同产地酿酒葡萄“赤霞珠”果肉中有机酸含量(mg/g·FW)

注:同一列数字后不同小写字母表示差异达到显著水平p<0.05。

表5　不同产地酿酒葡萄“赤霞珠”果皮中有机酸含量(mg/g·FW)

注:同一列数字后不同小写字母表示差异达到显著水平p<0.05。

2.4不同产地酿酒葡萄“赤霞珠”果皮中有机酸含量

采用RP-HPLC法分别对不同产地酿酒葡萄“赤霞珠”果皮中6种有机酸进行分析,并根据外标法进行定量计算,结果如表5所示。结果表明,三产地酿酒葡萄“赤霞珠”果皮样品中均检测出草酸、酒石酸、L-苹果酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸。葡萄果皮中各有机酸含量与果肉不同,其中酒石酸和L-苹果酸含量共占有机酸总量的77%以上,构成了葡萄果皮中主要的有机酸;在果皮中所测定的6种有机酸在有机酸总量中所占比例表现为酒石酸>L-苹果酸>乳酸>琥珀酸>柠檬酸>草酸。由表5可知,三产地酿酒葡萄“赤霞珠”果皮有机酸总量之间均存在显著差异,其中山东烟台莱山葡萄果皮中有机酸总量最高为19.081 mg/g·FW,这主要体现在有机酸总量中所占比例最高的酒石酸含量达12.930 mg/g·FW,显著高于云南迪庆德钦的10.927 mg/g·FW和河北怀来沙城的9.825 mg/g·FW。另外,山东烟台莱山葡萄果皮中草酸含量达0.318 mg/g·FW,分别比云南迪庆德钦和河北怀来沙城高6.5倍及3.8倍。表5显示,虽然河北怀来沙城葡萄果皮中乳酸、柠檬酸和琥珀酸含量分别为2.234、0.930和0.631 mg/g·FW,比云南迪庆德钦高出0.560、0.132和0.169 mg/g·FW,但由于在对有机酸总量有主要贡献的酒石酸和L-苹果酸含量上云南迪庆德钦均显著高于河北怀来沙城,使得云南迪庆德钦葡萄果皮中有机酸总量较河北怀来沙城稍高。

3　讨论

葡萄果实中有机酸代谢是一个极为复杂的过程,其有机酸含量的高低一方面取决于品种或品系的基因型,另一方面还与葡萄的生长环境密和栽培措施等因素密切相关,这就使得同一葡萄品种在不同的地区呈现出不同的地域风格。葡萄果实中果肉(浆液)、果皮和果核所占比例大致为83%～92%、6%～12%和2%～5%,故葡萄果实中有机酸的种类与含量在很大程度上取决于葡萄果肉。

Falchi等应用高效液相色谱法对葡萄果肉、果皮和种子的成分分析,发现葡萄果实不同部位有机酸的含量存在差异,这表明葡萄果实中有机酸的代谢可能具有组织特异性[19]。由表3和表4可见,葡萄果肉和果皮中有机酸含量明显不同,葡萄果皮中除草酸外,其余5种有机酸含量均高于果肉,并且这6种有机酸在葡萄果肉和果皮有机酸总量中所占的比例也存在着一定的差异,但可以确定酒石酸和L-苹果酸共同构成了葡萄果实中主要的有机酸。Kliewer通过C14同位素示踪法,对不同温度下葡萄果实中有机酸和糖类C14含量变化进行了研究,结果表明在低温条件下,未成熟的葡萄果实中C14大多存在于有机酸中,而在近成熟的葡萄果实中有80%以上的C14被固定在糖中,并且在一定的温度范围内,温度越低苹果酸的含量就越高[20]。Liu Huaifeng等[21]也指出葡萄果实中的有机酸对气候非常敏感,且苹果酸对气候的敏感度要高于酒石酸。葡萄果实中L-苹果酸含量在始熟前(花后4～6周)达到最高,之后呈现下降趋势[22],这一时期恰与各产地的最热月相重叠,通过表1和表4可以看出,云南迪庆德钦和河北怀来沙城最热月均为7月,其平均温度分别为11.7 ℃和24.0 ℃,而山东烟台莱山最热月为8月,其平均温度为27.2 ℃,三产地酿酒葡萄“赤霞珠”果肉和果皮中L-苹果酸含量均与三产地最热月平均温度均呈现负相关(表4,5),这表明葡萄果实中L-苹果酸的含量可能与其成熟期的温度相关。此外,成熟期的温度还与葡萄果实中有机酸总量有关。有研究表明,苹果、葡萄、柿、菠萝、温州蜜柑、酸樱桃等多种果树,热量较高的地区果实中含酸量比热量较低的地区低[23]。与上述情况类似,云南迪庆德钦处于高海拔地区,葡萄成熟期的平均温度较低,且昼夜温差较大,而河北怀来沙城和山东烟台莱山均处于低海拔地区,同时受到季风的影响,使得这两产地葡萄成熟期的平均温度相比云南迪庆德钦较高,可能是由于较高的温度导致葡萄果实有机酸的代谢消耗,最终表现为总量上的差异(表4)。

葡萄果实中的草酸和酒石酸均来自于抗坏血酸[4],而L-苹果酸和柠檬酸则来自于三羧酸循环[2]。因此,外界环境因素可能通过调控其代谢途径中基因的表达量,最终影响有机酸的组成比例。虽然草酸和酒石酸、L-苹果酸和柠檬酸在代谢途径上具有一定的关联性,但在不同外界环境的影响下,同一生物合成途径中的碳流向仍具有一定的差异,此推测需进一步验证。

4　结论

本文分析测定了云南迪庆德钦、河北怀来沙城和山东烟台莱山三地的成熟期酿酒葡萄“赤霞珠”果实中6种主要有机酸的含量。结果表明,不同产地的葡萄果肉和果皮中有机酸总量上存在明显差异(p<0.05)。6种主要有机酸在不同产地葡萄果皮和果肉中含量均不同,其中酒石酸与L-苹果酸共同构成了酿酒葡萄果肉和果皮中最主要的有机酸。酿酒葡萄果实中有机酸的含量与产地气候相关,但其仍不足以判定酿酒葡萄的品质,我们还将结合其他相关理化指标,更具体地探讨我国不同产地酿酒葡萄的品质差异,为我国葡萄酒地方特色的形成提供指导。

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Difference of organic acids in ripen berry of wine grape(CabernetSauvignon)among production regions

ZHAO Yue1,HAN Ning1,SUN Yu-xia2,SUN Qing-yang1,HAN Ai-qin1,ZHAO Xin-jie1,*

(1.College of biological engineering,Qi Lu University of Technology,Jinan,Jinan 250353,China;2.Institute of Agro-food Science and Technology,Shandong Academy of Agricultural Sciences,Jinan,Jinan 250100,China)

Six organic acids in berries of wine grape(Cabernet Sauvignon)from three production regions(Deqin in Yunnan,Huailai in Hebei and Laishan in Shandong)in China were analyzed by high performance liquid chromatography(HPLC). The results showed that the total organic acids and six organic acids in the pulp and skin of berries from different production regions had obvious differences(p<0.05). Among three production regions,the highest content of organic acids in the pulp and skin were Deqin in Yunnan(11.434 mg/g·FW)and Laishan in Shandong(19.081 mg/g·FW),respectively. Moreover,the contents of tartaric acid and L-malic acid accounted for 86.5% and 77.0% of the total organic acids in the pulp and skin,so they together made up the main organic acids in the pulp and skin of berry. The skin of berry contained more tartaric acid,L-malic acid,lactic acid and citric acid than the pulp among three production regions. But except Laishan in Shandong,the content of oxalic acid in the pulp was higher than the skin in the other two regions. In brief,the distribution of organic acids in berries of wine grape(CabernetSauvignon)has tissue specificity,and the content of organic acids is closely related to the climate of production regions.

production regions;wine grape;organic acids

2015-04-29

赵悦(1989-)，男，硕士研究生，研究方向：现代酿酒技术，E-mail：zhaoyue_0335@126.com。

赵新节(1962-)，男，博士，教授，研究方向：现代酿酒技术，E-mail：zhaoxinjie1177@163.com。

山东省自然科学基金项目(ZR2013CQ022)；山东省现代农业技术体系水果产业创新团队项目(SDAIT-03-021-12)。

TS261.2

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000