传统发酵牦牛酸乳中高产胞外多糖乳酸菌的筛选与鉴定

陈孝勇,赵　欣,骞　宇,李　键,陈炼红,陈　娟,索化夷,*

(1.西南大学食品科学学院,重庆 400715;2.西南大学 重庆市特色食品工程技术研究中心,重庆 400715;3.重庆第二师范学院生物与化学工程系,重庆 400067;4.西南民族大学青藏高原研究院,四川成都 610041;5.西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041)



传统发酵牦牛酸乳中高产胞外多糖乳酸菌的筛选与鉴定

陈孝勇1,2,赵欣3,骞宇3,李键4,5,陈炼红4,5,陈娟5,索化夷1,2,*

(1.西南大学食品科学学院,重庆 400715;2.西南大学 重庆市特色食品工程技术研究中心,重庆 400715;3.重庆第二师范学院生物与化学工程系,重庆 400067;4.西南民族大学青藏高原研究院,四川成都 610041;5.西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041)

目的:以四川红原、西藏羊八井地区传统牦牛酸乳中分离出的57株乳酸菌作为实验菌种,筛选出高产胞外多糖乳酸菌。方法:通过菌落拉丝法、硫酸-苯酚法的测定。结果:实验菌株胞外多糖产量在19.95～91.08 μg/mL之间,其中菌株代号为32-2、67-1、41-1和27的胞外多糖产量较高,分别为91.08、89.76、87.22、87.40 μg/mL。通过16S rDNA序列同源性鉴定表明代号32-2菌株鉴定为屎肠球菌(Enterococcus faecium)、代号67-1菌株为肠膜明串株菌肠膜亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides)、代号41-1菌株为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、代号27菌株为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)。结论:为研究具有提高酸乳品质能力的发酵菌株提供依据。

牦牛酸乳,乳酸菌,胞外多糖,筛选,鉴定

保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌是酸奶生产中常用发酵菌种,但随着发酵乳制品多样化的发展,传统乳酸菌发酵已经不能满足人们对产品的需求,因此,筛选性能良好的乳酸菌对发酵乳制品的生产具有重要意义。同时我国酸奶发酵剂多从国外引进,缺乏自主知识产权酸奶发酵剂。张和平等[1]从酸马奶中得到一株凝乳快速、产酸力强、凝乳质地优良及益生特性良好的Lactobacillus casei Zhang;Galle等[2]从酸面包中分离出乳酸菌所产胞外多糖可改善发酵食品的质构;Pradip等[3]从印度发酵酸奶中分离获得一株产胞外多糖发酵乳杆菌,该菌能够提高低脂酸奶的感官品质及流变学特性。可见,筛选可作为发酵菌株的乳酸菌已迫在眉睫。我国传统发酵食品极度丰富,如豆豉、酱油、酸马奶、酸面团等,是构建具有自主知识产权乳酸菌菌种资源库和开发自主知识产权发酵剂的重要来源。乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生长代谢过程中形成的位于细胞壁外的粘液多糖或荚膜多糖。研究发现向发酵乳制品中添加乳酸菌胞外多糖能够改善发酵乳制品的流变学特性、质构和口感等[4]。此外,对胞外多糖的结构、代谢途径及功能性质的研究表明,胞外多糖具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等作用[5-7]。因此,研究产胞外多糖乳酸菌不仅为改善发酵乳制品的品质研究做出贡献,提高酸奶益生价值,使性能良好的乳酸菌得以利用,还可以促进EPS分子结构、生理功能与分子作用机制的进一步研究。目前发现产胞外多糖的常见乳酸菌[8]有干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。

牦牛酸乳是我国传统发酵食品之一,是青藏高原地区牧民喜爱的美食。青藏高原地区牧民沿袭传统古老工艺,自然发酵而成,具有悠久的历史,经过自然长期的选择和驯化,一些具有独特优良特性的乳酸菌被保留下来。因此,研究牦牛酸奶中的乳酸菌对发酵乳制品的品质及生产均有重要作用。本研究通过对传统发酵牦牛酸乳中高产胞外多糖乳酸菌进行筛选,评价出牦牛酸奶中产胞外多糖能力强的乳酸菌,为探索具有提高酸奶品质的自主知识产权发酵菌株提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌种来源从四川红原、西藏羊八井地区的传统牦牛酸乳中分离出的57株乳酸菌菌株,西南大学食品科学学院保藏。

1.1.2试剂蛋白胨、牛肉膏、吐温80、磷酸氢二钾、酵母粉、硫酸镁、柠檬酸三铵、葡萄糖、蔗糖、硫酸锰、乙酸钠、琼脂、透析袋(MD34,截留分子量3000～14000)北京索莱宝科技有限公司。三氯乙酸、乙醇、苯酚、浓硫酸均为分析纯成都市科龙化工试剂厂。λDNA/HindⅢ、6×DNA Loading Buffer、100 bp DNA Ladder、细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)、2×Taq PCR MasterMix天根生化科技(北京)有限公司。上游引物27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3)、下游引物1495R(5-CTACGGCTACCTTG TTACGA-3)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2仪器与设备

密封培养罐2.5L日本三菱瓦斯化学株式会社;隔水式恒温培养箱,GHP-9160上海齐欣科学仪器有限公司;离心机,5810德国Eppendorf公司;磁力搅拌器,78-1常州溴华仪器有限公司;紫外-可见分光光度计,T6新世纪北京普析通用仪器有限责任公司;小型水平电泳槽,Mini-Sub Cell GT美国Bio-Rad公司;梯度PCR仪,S1000 Thermal Cycler美国Bio-Rad公司;洁净工作台,SW-CJ-2F苏州安泰空气技术有限公司。

1.3实验方法

1.3.1产胞外多糖乳酸菌的初步筛选利用菌落拉丝法[9],将已分离纯化的57株乳酸菌在MRS固体筛选培养基上进行划线分离,并用胶带将平板封口,在30℃厌氧条件下培养48 h,观察并记录菌落特征。用无菌牙签接触菌落,轻轻地向外拉,记录2 s内垂直离开培养基表面形成连续拉丝的最大长度(mm),重复操作5～6个菌落,每个菌落平行做三次,结果以“平均值±标准方差”来表示,初步筛选能产胞外多糖的乳酸菌。

1.3.2乳酸菌胞外多糖的提取将菌落拉丝法初筛得到的菌株分别接种于10 mL MRS液体筛选培养基中,30℃培养24 h。取10 mL 30℃下培养24 h的乳酸菌培养液,加入250 μL 80%(体积分数)的三氯乙酸,脱除蛋白质,8000 r/min离心20 min去菌体,离心后的上清液装入透析袋中置于磁力搅拌器中用蒸馏水透析48 h。透析液中加入3倍体积的95%乙醇,4℃下冷藏过夜,多糖呈絮状沉淀析出,在4℃、10000 r/min离心20 min,弃掉上清液,收集沉淀溶于10 mL蒸馏水中,备用。

1.3.3乳酸菌胞外多糖含量测定在乳酸菌胞外多糖水溶液中加入6%苯酚溶液和98%浓硫酸,室温下放置10 min后摇匀,静置20 min后于490 nm处测定吸光度,以空白培养基为对照,重复操作3次。然后准确称取50 mg经105℃烘干至恒重的葡萄糖于250 mL容量瓶中,蒸馏水定容。稀释成0、20、40、60、80、100 μg/mL的葡萄糖标准溶液,于490 nm处测定吸光度,根据结果绘制成葡萄糖标准曲线。最后按标准曲线方程计算胞外多糖含量。

1.3.4高产胞外多糖乳酸菌的鉴定及系统发育树的构建用接种环接种活化后的高产胞外多糖乳酸菌于5 mL MRS液体培养基中,30℃培养24 h,备用。按细菌基因组DNA提取试剂盒说明书中方法提取高产胞外多糖乳酸菌的总DNA(模板),利用0.7%琼脂糖凝胶电泳进行检测。PCR反应体系为25 μL:模板1 μL,引物27F、1495R各1 μL,2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,加无菌超纯水补足至25 μL。PCR反应条件:94℃ 5 min;94℃ 40 s,55℃ 40 s,72℃ 1 min,共35个循环;72℃ 10 min。反应结束后,取5 μL PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测,将PCR产物送华大科技有限公司测序,测序结果提交到NCBI中的GenBank,使用Blast程序寻找与其有最大同源性的序列,最终确定高产胞外多糖乳酸菌的种属关系。

表1　乳酸菌在MRS筛选培养基上的粘丝长度

注:“+”表示粘液状;“-”表示无粘性。

调取GeneBank数据库中收录的10个种的10株乳酸菌的相同区段基因序列,用Clustalx1.83软件中的Alignment程序对测得序列和BLAST检索所得参考序列进行多序列匹配比对,再用MEGA5.0软件中Kimura 2-parameter模式计算遗传距离,邻位相连法构建分离乳酸菌的同源序列系统进化树,系统树的每个分支采用自举法进行置信度检测,自举数据集为1000[10-12]。

2　结果与分析

2.1菌落拉丝法初步筛选产胞外多糖乳酸菌结果

胞外多糖是长链、高分子质量的多糖,相对分子质量在4.0×104～6.0×106之间,使得产胞外多糖乳酸菌可表现为粘丝状,故可以通过菌落拉丝法进行初步筛选。57株乳酸菌中有19株菌具有菌落拉丝特性,拉丝长度介于10.8±2.3～43.0±6.2 mm之间,17株菌菌落呈粘液状,21株菌菌落无粘性。

图1　MRS筛选培养基上的粘性菌落Fig.1　MRS screening medium viscosity colonies注:A:32-2菌落拉丝图,B:88粘液菌图。

2.2硫酸-苯酚法测定乳酸菌胞外多糖含量结果

经测定表明,不同菌株胞外多糖产量有所不同,由表2知,实验菌胞外多糖产量介于19.95～91.08 μg/mL之间,产量较高的菌株代号为32-2、67-1、41-1和27,产量分别为91.08、89.76、87.22、87.40 μg/mL。Cerning等[13]研究干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)的胞外多糖产量在50～155 μg/mL之间,Aslim等[14]从土耳其酸奶中分离出的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的最大产量114 μg/mL,Prasanna等[15]研究的婴儿乳杆菌(Bifidobacterium infantis)的胞外多糖产量为102 μg/mL。马静等[16]研究发现菌种、温度、pH、发酵时间以及培养基组分对乳酸菌胞外多糖产量均有影响,如德氏保加利亚乳杆菌NCFB2772以葡萄糖为碳源的胞外多糖产量是果糖的2倍;Lin等[17]认为发酵时间是影响胞外多糖产量、分子量和组成的重要环境因素,向低脂脱脂牛奶中添加干酪素水解物能显著促进细胞的生长和提高胞外多糖的产量。由此可见,乳酸菌产胞外多糖能力除了与培养条件及营养物质的组成有关外,菌株的不同也是影响乳酸菌产胞外多糖能力的关键因素。

表2　36株乳酸菌产胞外多糖的含量

表3　高产酸菌株鉴定结果

2.3高产胞外多糖乳酸菌的16S rDNA序列同源性鉴定结果

16S rDNA鉴定是利用细菌16S rDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定,是一种快速获取细菌种属信息的方法。由图2可知,样品基因组DNA条带在23130 bp附近,条带完整,无拖尾。图3中PCR扩增后的目的片段接近1500 bp,条带无拖尾现象、清晰明亮,阴性对照无条带,说明PCR扩增效果较好。16S rDNA比对结果见表3。

图2　高产胞外多糖乳酸菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.2　Agarose gel electrophoresls of LAB with high exopolysaccharide-producing genomic DNA注:图2中M为λDNA/HindⅢ,1:32-2,2:27,3:41-1,4:67-1。

图3　高产胞外多糖乳酸菌PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.3　Agarose gel electrophoresls of LAB with high exopolysaccharide-producing PCR production注:图3中M为100bp DNA Ladder,0:阴性对照,1:32-2,2:27,3:41-1,4:67-1。

2.4系统发育分析

系统发育树表明不同属的乳酸菌聚在各自分支内,分支长度的大小代表物种进化程度的高低。由图4可知,实验菌株涉及肠球菌属、乳杆菌属和明串珠菌属,属于明串珠菌属的菌株27、67-1以100%的自举支持率与肠膜明串珠菌处于同一分支上,二者的16S rDNA序列较相似,差异小,亲缘关系较近;属于肠球菌属的菌株32-2以79%的自举支持率与屎肠球菌聚在一起;菌株41-1被明确的分类在乳杆菌属,因其以63%的自举支持率在系统发育树中与副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌被分类到一起。此外,菌株41-1似乎与干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌具有同样的关系(100%的自举支持率),因为菌株41-1的16S rDNA序列与干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌的序列具有非常高的同源性,故而能聚在同一分支。通过系统发育树可以得到乳杆菌属的菌株41-1与肠球菌属的菌株32-2的情缘关系较近,与明串珠菌属的27、67-1的亲缘关系较远。

图4　乳酸菌16S rDNA序列的系统发育树Fig.4　Phylogenetic tree of LAB based on 16S rDNA sequences

3　结论

通过对传统发酵牦牛酸乳中高产胞外多糖乳酸菌的筛选,得到4株高产胞外多糖乳酸菌,30℃培养24 h的产量在87.40 μg/mL以上。通过分子生物学鉴定结果表明,代号32-1菌株为屎肠球菌、代号67-1菌株为肠膜明串株菌肠膜亚种、代号41-1菌株为干酪乳杆菌、代号27菌株为肠膜明串珠菌。四株菌在传统发酵牦牛酸乳品质形成中具有重要作用,可作为筛选具有提高牦牛酸乳品质能力的发酵菌株。

研究发现传统发酵牦牛酸乳中存在高产胞外多糖肠膜明串珠菌,该种属菌株高产胞外多糖在发酵食品中鲜有报道。研究说明肠膜明串珠菌对牦牛酸乳品质形成发挥一定作用。

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Screening and identification of lactic acid bacteria strains with high exopolysaccharide-producing from traditional fermented Yak Yogurt

CHEN Xiao-yong1,2,ZHAO Xin3,QIAN Yu3,LI Jian4,5,CHEN Lian-hong4,5,CHEN Juan5,SUO Hua-yi1,2,*

(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China; 2.Chongqing Engineering Research Center of Regional Food,Chongqing 400715,China; 3.Department of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China; 4.Institute of Qinghai-Tibetan Plateau,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China; 5.College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

Objective:Screening lactic acid bacteria(LAB)with high exopolysaccharides from 57 strains of lactic acid bacteria,which were isolated and purified from traditional fermented Yak Yogurt in Hongyuan-Sichuan and Yangbajing-Tibet.Methods:The strains with high exopolysaccharides(EPS)were screened by colony thread-drawing method and phenol-sulfuric acid method.Results:The four strains,screening number 32-2,67-1,41-1 and 27,possessed the high exopolysaccharide-producing and the production was 91.08,89.76,87.22,87.40 μg/mL respectively.Based on 16S rDNA sequence analysis,32-2 was identified as Enterococcus faecium,41-1 as Lactobacillus casei,67-1 as Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides,27 as Leuconostoc mesenteroides.Conclutions:This study could provide the evidence for researching fermentation strains to improve yogurt quality.

Yak Yogurt;Lactic acid bacteria;Exopolysaccharide;screening;identification

2015-09-21

陈孝勇(1991-)，男，硕士研究生，研究方向：发酵微生物，E-mail：chenxiaoyong522@163.com。

索化夷(1978-)，男，博士，副教授，研究方向：发酵微生物，E-mail：birget@swu.edu.cn。

国家公益性行业(农业)科研专项(201203009)；重庆市基础与前沿研究计划项目(CSTC2013JCYJA80006)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)07-0143-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.020