油桐尺蛾中肠上皮细胞的原代培养

钟雅婷，罗 辑，蒋学建，黄华艳

(广西壮族自治区林业科学研究院、广西优良用材林资源培育重点实验室，广西 南宁 530002)

油桐尺蛾中肠上皮细胞的原代培养

钟雅婷，罗 辑，蒋学建，黄华艳

(广西壮族自治区林业科学研究院、广西优良用材林资源培育重点实验室，广西 南宁 530002)

为建立可供油桐尺蛾基础生物学研究的油桐尺蛾中肠上皮原代细胞系，采用组织块法、胰酶消化法和机械分散法分别对油桐尺蛾中肠上皮组织细胞进行体外培养。结果表明：组织块法培养效果最佳，细胞贴壁较好且生长旺盛。细胞移入培养瓶72 h可观察到细胞从组织块中迁移出来，呈细长梭形，随后数量增多形成网状集落，可维持良好的生长状态达60 d。说明油桐尺蛾中肠上皮原代细胞的最佳培养方法为组织块法。

油桐尺蛾；原代细胞培养；组织块法；中肠上皮细胞

随着昆虫细胞培养技术的飞速发展以及分子生物学、基因工程学研究的不断深入，昆虫细胞系越来越广泛地应用于细胞生物学、发育生物学以及细胞工程学等多个领域。鳞翅目昆虫如暴发成灾在农林业生产中可产生较大危害，因此建立鳞翅目昆虫细胞系能够为体外进行体细胞遗传、昆虫抗性机制研究等提供可靠的实验细胞模型，还可通过对昆虫病毒在昆虫细胞内的感染和复制机制进行研究，从而探索杀灭害虫的新途径。

油桐尺蛾又名油桐尺蠖(Buzurasuppressaria)，属鳞翅目(Lepidoptera)尺蛾科(Geometridae)的一种食叶性害虫，广泛分布于我国湖南、江西、安徽、浙江、福建、广东、广西、四川、贵州以及海南等地，是油桐、茶树、柑桔以及桉树等经济林木的主要害虫[1-3]。目前，已成功建立了多种鳞翅目昆虫细胞系，但对油桐尺蛾细胞培养系的研究还相对较少。为了建立可供油桐尺蛾基础生物学研究的油桐尺蛾组织原代细胞系，本研究开展了油桐尺蛾中肠上皮细胞原代培养方法以及培养条件的选择试验，初步建立适合油桐尺蛾中肠上皮细胞的原代培养方法。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂

1.1.1 材料来源 油桐尺蛾6龄期幼虫为本实验室采用人工室内孵化饲养。

1.1.2 培养基 Grace′s昆虫细胞培养基和胎牛血清均购自gibco公司；试验其他所用试剂均为国产分析纯。

1.2 油桐尺蛾中肠上皮组织材料的获取

将油桐尺蛾6龄期幼虫浸泡于装有2%次氯酸钠溶液的灭菌器皿内10～15 min，再用75%乙醇溶液浸泡消毒15～20 min，用灭菌水洗涤2～3次，之后将虫体置于无菌滤纸上吸干其表面水分。在无菌操作台上用已消毒的眼科剪和镊子将幼虫的肠道取出并清除其内容物、围食膜以及黏连的脂肪组织等，将肠道转移至无血清Grace′s昆虫细胞培养液中，洗涤3次，备用。

1.3 中肠上皮组织原代细胞培养

1.3.1 组织块法 将肠道组织用无血清Grace′s昆虫细胞培养液洗涤2～3次后纵向剪开并平展于培养皿中，用已消毒的眼科剪将其剪成面积约为5 mm×5 mm大小的肠道植块。将植块的内膜面朝下平贴于细胞培养瓶的培养面上，之后将细胞瓶放入28 ℃细胞培养箱中静置1.5～2 h(干贴壁)，随后向其中加入含有15%灭活标准胎牛血清和青链霉素混合液(青霉素100 U·mL-1，链霉素0.1 mg·mL-1)以及2.5 μg·mL-1两性霉素B的Grace′s昆虫细胞培养液。将细胞培养瓶置于28 ℃细胞培养箱中静置培养，每天对细胞的生长情况进行观察，于接种7 d后更换培养液，之后视细胞生长情况进行处理。

1.3.2 胰酶消化法 将肠道组织用无血清Grace′s昆虫细胞培养液洗涤2～3次后，用已消毒的眼科剪将之剪碎成大小为1.0 mm3大小的组织块，放入装有5倍体积0.25%胰蛋白酶的平皿中进行消化；于37 ℃消化1 h后将消化的细胞悬液连同组织块一起收集于离心管中，1000 r·min-1离心10 min并弃掉上清液，向其中加入Grace′s昆虫细胞培养液后用吸管温柔吹打分散细胞，之后按1×106个·mL-1细胞密度接种于细胞培养瓶中；向培养瓶中加入含有15%灭活标准胎牛血清和100 U·mL-1青、链霉素以及2.5 μg·mL-1两性霉素B的Grace′s昆虫细胞培养液。随后操作同1.3.1。

1.3.3 机械分散法 将处理好的肠道组织剪碎成0.5～1 mm3大小的组织块，向其中加入Grace′s昆虫细胞培养液并用灭菌吸管温和抽吸吹打，之后直接将悬液连同组织块一起接种于细胞培养瓶中，加入含15%灭活标准胎牛血清和100 U·mL-1青、链霉素及2.5 μg·mL-1两性霉素B的Grace′s昆虫细胞培养液。随后操作同1.3.1。

2 结果与分析

2.1 油桐尺蛾中肠上皮原代细胞生长特点

在倒置显微镜下观察刚接种的油桐尺蛾肠道组织细胞悬液，可见游离的细胞悬浮其中，形态以较规则的圆形和椭圆形为主，未消化完全的组织块则沉于瓶底；培养72 h后，大多数细胞贴壁，其内充满颗粒样物质(图1)；5～10 d时可观察到贴壁的细胞明显拉伸，形状不规则，且一端伸展呈丝状，细胞核较大，为长椭圆形(图2)；15～20 d后观察到细胞开始逐渐集聚、融合，游离的细胞减少，细胞与细胞间的丝状拉伸相互连接，从而使细胞质相互沟通，最后形成一个细胞质均一的组织块(图3)，这种组织块通常易在细胞生长密集区域形成，而在细胞稀疏的地方则形成较晚或不形成；培养40 d后细胞颜色逐渐由透明变暗，聚集拉伸不显著，出现老化现象，新生细胞未见增多，部分细胞发生萎缩，细胞内颗粒物质较多(图4)；培养60 d后观察到部分细胞老化变圆，边缘发黑，细胞核萎缩呈圆形，最终细胞发生脱落，另一部分贴壁细胞则生长呈花瓣状，最后发生崩解(图5)。

图1 培养72h(20×)图2 培养5～10d(20×)图3 培养15～20d(40×)图4 培养40d(40×)

2.2 不同培养方法比较

本研究分别采用了组织块法、胰酶消化法及机械分散法对油桐尺蛾中肠上皮细胞进行培养。其中，组织块法培养72 h左右可见部分细胞沿组织块边缘爬出，呈纤细的长梭形，随后数量逐渐增多并缓慢向外扩张形成网状集落，细胞贴壁较牢，生长状况较好；胰酶消化法能获得大量的悬浮细胞，多数细胞呈圆形或椭圆形，大小不一，但较难贴壁或贴壁不牢，培养14 d后仍可见大量游离细胞存在；机械分散法可观察到培养液中有大量组织块及少量悬浮细胞存在，培养3～4 d后可见少量细胞从组织块边缘探出，但由于组织块不贴壁或少量贴壁，因此细胞生长缓慢且贴壁不牢。

3 结论与讨论

本研究采用组织块法、胰酶消化法和机械分散法分别对油桐尺蛾中肠上皮细胞进行体外培养实验，结果表明组织块法的培养效果最好，为下一步进行油桐尺蛾中肠上皮细胞分化，最终筛选出稳定传代的细胞系奠定基础。

自Grace[4]于1962年建立桉蚕蛾(Antheraeaeucalypti)细胞系至今，研究者们已先后建立了500多株昆虫细胞系。昆虫细胞系在昆虫生理生化研究、生物反应器及其表达基因产物的探索方面发挥了重要作用，作为一种研究工具越来越多地应用在农业、医学以及生物学等领域[5-6]。这些已建立的昆虫细胞系大部分源自于双翅目和鳞翅目昆虫，主要为昆虫的胚胎、卵巢、精巢、初孵的幼虫、血液以及脂肪体等组织和器官，而其中又以卵巢和胚胎组织多见。目前已建立的油桐尺蛾细胞系为血球细胞系(WIV-BS-02)[7]以及成虫卵巢细胞系(Bs484)[8]，但目前还尚未有油桐尺蛾中肠上皮细胞进行原代培养的报道。为建立可供油桐尺蛾基础生物学研究的原代细胞系，本研究进行油桐尺蛾中肠上皮组织细胞的培养，初步建立适合油桐尺蛾中肠上皮组织原代细胞培养的技术方法。

中肠上皮细胞的分离，通常采用贴壁组织块或细胞在细胞培养瓶或培养板中离体培养的方法。细胞在贴附和伸展因子的诱导下附着于细胞培养面，由层粘连蛋白与胶原家族分子共同作用促进其生长和分化[9]。组织块培养法在培养昆虫其他组织(如脂肪体和卵巢组织)均取得了很好的效果[10]。张欣[11]运用组织块培养的方法成功将来源于黄粉虫的脂肪体细胞以及喙尾琵琶甲的精巢细胞培养成有限细胞系，最长存活超过20个月。Zhang等通过组织块法分别对棉铃虫(Helicoverpaarmigera)和甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)脂肪体细胞进行培养，成功建立了IOZCAS-Ha-I[12]以及IOZCAS-Spex-II、IOZCAS-Spex-III细胞系[13]。Shao等[14]采用组织块法成功建立了棉铃虫表皮细胞系HaEpi。刘淑珊等[15]通过对柞蚕卵巢细胞进行原代培养，认为组织块培养法较悬浮细胞培养法效果更好。本研究亦采用组织贴块法对油桐尺蛾中肠上皮细胞进行分离培养，发现细胞较易贴壁生长，最终获得了良好的原代培养细胞，但由于组织块体积较大，因此需要很长一段时间来等待细胞从组织块中迁移出来。有研究认为尽管采用上述2种方法易获得均一的单层细胞悬液，但用胰蛋白酶以及EDTA等对昆虫组织进行解离可能会造成其受到损伤[16]，而机械分散法则可能使组织在处理过程中由于研磨过度而发生细胞破碎，形成较多杂质。但同时亦有报道表明，用胰酶消化法和机械分散法是培养昆虫组织原代细胞的最佳方法[17-18]。因此，从培养结果来看，上述3种方法对不同昆虫组织的影响各有区别，具体该采用何种方法应根据不同昆虫的不同组织来定。而在本研究中对于油桐尺蛾中肠上皮细胞来说，组织块法处理的细胞较胰酶消化法以及机械分散法要好。

昆虫的消化道由前肠、中肠以及后肠组成，鳞翅目昆虫的前肠和后肠均源自外胚层，而中肠则来源于内胚层[9]。中肠是昆虫分泌消化酶从而对食物进行消化吸收的重要部位，但由于中肠组织是由多层细胞构成，所以初代培养时也难免有其他组织混杂其中，如脂肪体和马氏管等，因此细胞呈多形性。井上元等[19]研究发现，这些昆虫细胞培养中形成网状结构为细胞分化所形成的有节律性收缩的肌肉组织，是细胞分裂的重要场所。另有研究者认为，当细胞贴附在支持物上之后，它们原先在生物体内时的特征即丧失，通常表现为形态上呈单一化，并反映其胚层的起源，即“返祖现象”，例如来源于内、外胚层的细胞多呈上皮型，而来源于中胚层的细胞则呈成纤维细胞型[20]。本研究所培养的中肠上皮细胞来源于内胚层，因此上述理论对其培养具有重要的参考价值。

血清因其内含有丰富的生长因子、脂类、蛋白质以及无机盐等营养物质和微量元素，故而是昆虫细胞培养中用量最大的天然添加剂，对细胞的生长和增殖发挥着重要作用[21]。Castagnola等[22]在培养烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)中肠原代细胞的过程中发现，向细胞培养液中添加一定量的血清能够增加中肠干细胞的分化。但另有研究表明，由于血清中含有的纤粘连蛋白能够选择性促进成纤维细胞增殖，但对上皮细胞则产生抑制作用，所以在体外进行初代细胞培养时不可多加血清[23]。因此，对不同组织来源的昆虫细胞进行培养时，血清的用量应仔细斟酌，视细胞的生长状况而定。

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Primary Culture of Midgut Epithelial Cell fromBuzurasuppressaria

ZHONG Ya-ting，LUO Ji，JIANG Xue-jian，HUANG Hua-yan

(GuangxiZhuangAutonomousRegionForestryResearchInstitute，GuangxiKeyLaboratoryofSuperiorTimberTreesResourceCultivation，GuangxiZhuangAutonomousRegion，Nanning530002，Guangxi,China)

This study was aim to establish midgut epithelial cellline ofBuzurasuppressariaGuenee for basic biology research. Midgut fragements of the moth were isolated and cultured with block explant culture technique，trypsin enzymatic digestion or mechanical dispersion in vitro. The results showed：the best cultivation was found from cells cultured with block explant culture technique，assessed by good cell adherence and growth.Epithelial cells started to migrate out from tissue blocks after 72 hours culture, shaped as fusiform and later reticular coloney growth with higher number.The cells could grow well until 60th day.We conclude that the explant culture technique using tissue blocks is best suited for primary cell culture ofB.suppressariaGuenee midgut epithelial cells .

Buzurasuppressaria；primary cell culture；tissue explant；midgut epithelial cell

2015-10-28；

2015-12-03

广西林业科技项目(桂林科字[2014]第17号)；广西优良用材林资源培育实验室自主研究课题(13-A-04-01)

钟雅婷(1985—)，女，广西桂林人，广西壮族自治区林业科学研究院工程师，硕士研究生，从事森林病虫害研究。E-mail：zhongya528@163.com。

罗辑(1985—)，男，湖南长沙人，广西壮族自治区林业科学研究院副研究员，博士，从事森林病虫害研究。E-mail：luoji00531ji@hotmail.com。

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.03.004

S763.42

A

1002-7351(2016)03-0015-05