有机化工废水COD高效降解菌的分离筛选及应用

张为艳，刘鹏程，郑凤娟，吴　敏，张文武

（1.杭州秀川科技有限公司，浙江杭州311121；2.浙江大学生命科学学院，浙江杭州310058）

有机化工废水COD高效降解菌的分离筛选及应用

张为艳1，2，刘鹏程1，郑凤娟1，吴敏2，张文武1，2

（1.杭州秀川科技有限公司，浙江杭州311121；2.浙江大学生命科学学院，浙江杭州310058）

利用有机化工废水培养基从新疆高海拔盐湖样品中分离筛选到COD降解菌18株，对COD降解率高的8株菌株混合后处理废水，与其他普通活性污泥相比，COD去除率更高（86.3%）。经16S rDNA初步鉴定，该8株菌分别属于拟杆菌门Bacteroidetes、厚壁菌门Firmicutes和变形菌门Proteobacteria。将该混合菌群用于生物曝气池试验，添加尿素0.75 g/L作为氮源，其COD降解率可达82.5%；添加金枪鱼蛋白胨0.5 g/L可使COD降解率提高到92.2%。

有机化工废水；菌株筛选；COD降解

化工行业作为我国经济的支柱产业之一，带来了巨大的经济效益，但同时也造成严重的环境污染〔1〕。特别是化工产业在生产过程中排放的大量有机废水，严重危害人类的健康及生态环境的平衡。化工废水种类繁多，组分复杂，含有许多有毒、剧毒或致癌物质，且废水的有机物浓度高，一旦排进水体，会在水中氧化分解，消耗大量溶解氧，严重的会造成水生生物死亡。此外，化工行业用水量非常巨大，排放的污水量也非常大，水质、水量波动性大，难以治理，对生态安全和人体健康造成严重的威胁。

如何处理排放量巨大的化工有机废水是目前面临的一个严峻课题。对于有机化工废水的处理技术也有较多研究〔2-3〕，主要包括破坏法（生化法、氧化法和焚烧法等）和回收法（膜分离法、萃取法和吸附法等）。其中生化法具有经济、环保的优点，越来越受到关注，而生化法的核心是菌种，因此，菌种的筛选和工艺及相关条件的优化是最关键的因素。笔者用有机化工废水培养基从高海拔盐湖样品中分离筛选COD降解菌，以期获得对化工有机废水COD降解率高的菌株及混合菌群，并将其用于生物曝气试验。

1　材料与方法

1.1试验废水及水质

试验废水采自湖北省某化工厂，为强酸性高浓度废水，pH为1，盐度4%，废水中含有机溶剂甲醇、甲苯及正丁醇等，COD为16160mg/L，TP为3.2mg/L，NH3-N未检出。

1.2菌株来源、驯化与分离纯化

菌株分离样品采自新疆高海拔盐湖，其中阿牙克库木湖盐度4.25%，鲸鱼湖盐度2.1%，阿其克库勒湖盐度7.18%，阿其克库勒湖7.82%，艾比湖盐度3.5%，伊吾湖盐度6.94%。

培养基：将试验废水pH调节至7.0左右，向其添加1 g/L酵母粉、1 g/L蛋白胨，121℃灭菌20 min。若为固体培养基，则向其添加2%的琼脂粉。

将各盐湖的样品按等比例混合，以10%的接种量接种于无菌废水培养基中，28℃、120 r/min摇床振荡培养2 d，取10%培养物重新接种于无菌废水培养基中继续培养2 d，如此重复3次获得驯化菌群。菌株分离采用梯度稀释涂布法，将驯化后的菌液进行 0、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释，分别取200 μL各梯度稀释后的菌液涂布于固体平板上，于28℃恒温培养箱中培养，直至长出明显菌落。用接种环挑取形态不同的单菌落，对其进行划线纯化至新鲜固体平板中，重复纯化1次，至获得纯的单菌落。

1.3分离菌株对试验废水的处理

由于废水pH低，故先向废水中加入5 g/L CaCO3（方解石，0.044 mm，325目）反应3 h，将废水pH调至7.0左右，CaCO3处理结束后过滤除去沉淀，加入0.5 g/L尿素调节废水的碳氮比约为200∶5，得到处理后的废水。分别将分离的菌株扩大培养至菌浓度OD600为 0.5左右，与处理后的试验废水按体积比1∶2混合，置于250 mL锥形瓶中在28℃、120 r/min摇床处理，分别取0、24、48 h的样品测定其COD。通过比较COD去除率，获得COD高效降解菌（48 h COD去除率＞60%）的纯菌株。将获得的COD高效降解菌进行等比例混合，用废水对其驯化1周。取驯化后的混合菌群对试验废水进行处理，分别测定0、24、48 h后的COD。

同时进行普通活性污泥的废水COD降解试验，作为比较。其中普通活性污泥取自杭州市余杭镇污水处理厂好氧段的活性污泥，前期利用试验废水对该污泥进行驯化至稳定状态。

1.4高COD去除率菌株的初步鉴定

选取48 h COD去除率＞60%的菌株，利用酚/氯仿/异戊醇法提取各菌株DNA，利用引物27F和1492R对各DNA进行16S rRNA基因序列PCR扩增〔4〕，得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，将有条带的扩增产物送往测序公司（杭州铂尚生物测序有限公司）测序，测序结果提交至NCBI网站的blast在线比对软件（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行序列比对，对各菌株进行初步鉴定。

1.5混合菌群的生物曝气池工艺应用试验

采用图1所示简易装置模拟生物曝气池工艺，应用上述COD降解混合菌进行污水处理模拟试验。废水已调节pH至7.0左右，接菌量20%，容器有效容积2 L。启动曝气，体系连续出水，控制水力停留时间为48 h。

图1　生物曝气池模拟试验

1.6考察氮源对试验废水COD降解情况的影响

由于该试验废水的氮含量特别低，故添加不同量的尿素和金枪鱼蛋白胨（自制），研究适合COD降解试验的最优条件。

（1）添加尿素作氮源。尿素添加量分别为0、0.25、0.5、0.75、1 g/L，处理48 h后取样测定COD，观察尿素最适添加量。

（2）添加金枪鱼蛋白胨作氮源。金枪鱼蛋白胨的添加量分别为0、0.25、0.5、0.75、1 g/L，处理48 h后取样测定COD，观察金枪鱼蛋白胨最适添加量。

试验中COD的检测采用重铬酸钾法〔5〕。混合菌群处理试验废水时，其COD为3次平行试验的测定平均值。

2　结果与讨论

2.1菌株分离结果及其对试验废水COD的去除效果

试验共挑取18个单菌落，分别命名为PAS1～PAS18，分别进行纯化，获得纯培养物。试验废水的初始COD为16 160 mg/L，加入CaCO3处理3 h后COD为11 350 mg/L。取各菌株分别处理试验废水，48hCOD去除率＞60%的菌株有8株，分别为PAS1、PAS5、PAS6、PAS8、PAS11、PAS12、PAS15、PAS17，其具体COD去除率见表1。

表1　各菌株48 h对试验废水COD的去除率

将这8株菌株混合后对试验废水进行降解，COD由11 350 mg/L降为1 550 mg/L，其COD去除率比各单菌株的去除效果都好（COD去除率高达86.3%，见图2）。与普通活性污泥相比，混合菌群的48hCOD去除率明显高于普通污泥（62.3%），见图3。

图2　混合菌群对试验废水的COD降解效果

图3　混合菌群与普通活性污泥对COD的降解能力比较

2.2菌种鉴定结果

对试验废水COD去除效果较好的8株菌进行16S rDNA初步鉴定，这8株菌分别为Bacillus sp. PAS11、Flavobacterium sp.PAS5、Hyphomicrobium sp. PAS12、Ochrobactrumsp.PAS8、Pseudomonassp.PAS1、Sphingobacterium sp.PAS17、Staphylococcus sp.PAS6 和Stappia sp.PAS15。它们分别属于拟杆菌门Bacteroidetes（Flavobacterium sp.PAS5和Sphingobacterium sp.PAS17）、厚壁菌门Firmicutes（Bacillus sp.PAS11 和Staphylococcussp.PAS6）和变形菌门Proteobacteria （Hyphomicrobium sp.PAS12、Ochrobactrum sp.PAS8、Pseudomonas sp.PAS1和Stappia sp.PAS5）。据文献报道〔6-9〕，对处理废水的活性污泥进行可培和非培的研究，表明多数细菌属于拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门，试验结果与文献报道结果一致。

2.3混合菌群生物曝气池工艺应用试验结果及氮源试验结果

混合菌群对废水的生物曝气池工艺应用试验结果表明，48 h COD去除率较低（67.0%），这是由于废水含氮量低，而试验中未额外添加氮源。故需进一步研究氮源对COD降解率的影响。此外试验还发现该混合菌群的沉降性不佳，难以形成菌胶团。

氮源对COD降解率的影响如图4所示。

图4　氮源对COD降解率的影响

从图4可以看出，未添加氮源的空白对照组其48 h COD去除率为67.0%，添加尿素可以促进混合菌株降解COD，最适尿素添加量为0.75 g/L，其48 h COD降解率可达到82.5%。添加金枪鱼蛋白胨的效果更加明显，最适金枪鱼蛋白胨添加量为0.5 g/L，其48 h COD降解率可达到92.2%。

3　结论

（1）试验废水为有机化工废水，pH为1左右，加入NaOH调节pH后废水中会出现絮状物，改加CaCO3不但成本降低，其处理效果也较好，同时对COD也有一定的去除效果。（2）向有机化工废水中加入适量蛋白胨和酵母粉作为培养基，从盐湖样品中驯化、分离筛选出18株对该废水COD有降解能力的菌株，其中有8株菌对废水COD 48 h去除率＞60%，效果最好的菌株为 PAS6，其去除率高达81.6%。经16S rRNA初步鉴定，这8株菌分别属于拟杆菌门Bacteroidetes（Flavobacterium sp.PAS5和Sphingobacterium sp.PAS17）、厚壁菌门Firmicutes （Bacillus sp.PAS11和Staphylococcus sp.PAS6）和变形菌门 Proteobacteria（Hyphomicrobium sp.PAS12、Ochrobactrum sp.PAS8、Pseudomonas sp.PAS1和St-appia sp.PAS5）。将此8株菌混合后对试验废水进行处理，其48 h COD的去除率达到86.3%。（3）由于试验废水氮含量特别低，故需向其补充氮源，研究了尿素和金枪鱼蛋白胨对废水处理效果的影响，结果表明，在未添加氮源的条件下，48 h COD去除率为67.0%；添加0.75 g/L尿素可使48 h COD降解率达到82.5%；添加0.5 g/L金枪鱼蛋白胨后废水48 h COD去除率可达92.2%，表明金枪鱼蛋白胨为最适氮源。（4）生物曝气池工艺试验发现混合菌群的沉降性不佳，难以形成菌胶团。工程应用中可以考虑结合MBR工艺来增加曝气池中菌体的浓度。

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Separation，screening and application of efficient degradation microorganisms for improving COD removing rates from organic chemical wastewater

Zhang Weiyan1，2，Liu Pengcheng1，Zheng Fengjuan1，Wu Min2，Zhang Wenwu1，2
（1.Hangzhou Trend Biotech Co.，Ltd.，Hangzhou 311121，China；2.College of Life Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

18 strains of COD degrading bacteria have been separated and screened from high altitude salt lake samples in Xinjiang Province by using organic chemical wastewater medium for treating wastewater，after mixed with 8 strains of bacteria which have high COD degrading rates.Compared to other ordinary activated sludge，the mixed strains show higher COD removing rate（86.3%）.Being identified preliminarily by 16S rDNA analysis，it shows that these 8 strains of bacteria belong to the varieties，including Bacteroidetes，Firmicutes and Proteobacteria.The mixed bacterial floras are used in bio-aeration pool tests.The COD removing rate could reach 82.5%，by adding 0.75 g/L of urea as nitrogen sources.The COD degrading rate could be improved to 92.2%，by adding 0.5 g/L of tuna peptone.

organic chemical wastewater；strain screening；COD degradation

X703

A

1005-829X（2016）08-0052-03

杭州市社会发展科研专项（20150533B68）

张为艳（1987—），博士。电话：0571-88579916，E-mail：zhangweiyan13@126.com。通讯作者：张文武，博士，电话：0571-88579916，E-mail：wenwu.zhang@trendbiotech.com。

2016-06-21（修改稿）