不同药物与消毒剂对兔球虫卵囊孢子化的影响

温福利， 张 嘉， 郑和平， 马 雷， 张诗兰， 王寿昆（.南京军区福州总医院比较医学科， 福州 35005；.福建农林大学动物科学学院， 福州 35000）

不同药物与消毒剂对兔球虫卵囊孢子化的影响

温福利1， 张 嘉2， 郑和平1， 马 雷1， 张诗兰1， 王寿昆2
（1.南京军区福州总医院比较医学科， 福州 350025；
2.福建农林大学动物科学学院， 福州 350002）

目的 对比研究不同抗兔球虫药物与消毒剂对兔球虫卵囊孢子化过程的抑杀效果，为兔球虫病的防治提供参考。方法 分别选取5种抗球虫药物和消毒剂进行抑制试验，观察它们对兔球虫卵囊体外孢子化过程的影响。结果 （1） 5种抗球虫药物对兔球虫卵囊孢子化抑制率大小依次为： 百球清＞优求乐＞球抑＞球肠清＞肠球双效，半数效量（EC50）大小依次为： 肠球双效＞球肠清＞球抑＞优求乐＞百球清； （2） 5种消毒剂对兔卵囊孢子化抑制率大小依次为： 二硫化碳＞苯酚＞氨水＞三氯异氰尿酸＞碘酊，半数效量大小依次为： 碘酊＞三氯异氰尿酸＞氨水＞苯酚＞二硫化碳； 半数孢子化时间依次为： 二硫化碳＞氨水＞苯酚＞三氯异氰尿酸＞碘酊。（3） 毒力较强的几种兔球虫卵囊耐药性大小依次为： 大型艾美耳球虫＞斯氏艾美耳球虫＞无残艾美耳球虫＞肠型艾美耳球虫。结论 15 mL/L百球清体外作用8 h对兔球虫卵囊孢子化抑制效果最强。体积分数6%二硫化碳作用于卵囊4 h，抑制兔球虫卵囊孢子化效果最好。兔球虫卵囊耐药性与虫体大小相关，较大虫体对药物敏感性高。

兔； 球虫病； 抗球虫药； 消毒剂； 卵囊孢子化

国内外文献［1-3］报道兔球虫由16种艾美耳属球虫（Eimeria）和1种等孢属（Isospora）球虫构成， 其中以穿孔艾美耳球虫为我国共患优势种［4］， 寄生于肝脏胆囊的斯氏艾美耳球虫致病性最强， 以混合寄生最为常见［5，6］。兔球虫病危害巨大， 以幼兔感染最为严重， 常导致幼兔死亡［7］。临床上检测母兔虽感染强度不高，但其幼兔易误食母兔粪便而感染兔球虫病， 所以母兔作为传染源严重危害兔群的健康［8，9］。卵囊是兔球虫与外界环境产生联系的主要方式， 只有在外界环境中发育的孢子化卵囊才具有感染宿主的能力。切断外界环境中卵囊的孢子化发育能很好控制兔球虫病在兔群中的传播［10-12］。薛占永等［13］曾报道了消毒剂对兔球虫卵囊抑制率的研究， 但未对兔球虫各种类卵囊抑制率进行进一步研究。目前， 关于抗球虫药物和消毒剂对兔球虫卵囊孢子化过程影响的报道很少。

1 材料与方法

1.1 兔球虫卵囊的采集

福州郊区某新西兰兔养殖场及某有生产许可证的新西兰兔生产单位［SCXK（闽）2014-0001］，采集刚排出的新鲜粪便样本587份，分别装入干净自封袋，标上采集信息，用保温箱带回实验室，置于4℃冰箱备查。

1.2 抗球虫药物与试验浓度梯度

球抑， 南京福斯特牧业科技有限公司生产， 生产批号： 20111116； 优求乐，广州华大实验兽药有限公司生产， 生产批号13061801； 百球清， 拜耳（四川）动物保健有限公司生产， 生产批号CN25266； 球肠清， 广州市广畜动物药业有限公司生产，生产批号： 20130101； 肠球双效， 南京龙马动物药业有限公司生产， 生产批号： 20130903。分别各设7组药物浓度， 浓度分别为口服推荐剂量的1/10倍、1/2倍、推荐剂量、2倍、10倍、30倍和60倍（表1）。1.3 消毒剂与试验浓度梯度

表1 不同药物试验用量

氨水，西陇化工股份有限公司生产，生产批号： 1309111； 甲醛溶液，西陇化工股份有限公司生产，生产批号： 1309252； 二硫化碳，西陇化工股份有限公司生产，生产批号： 1309262； 碘酊，山东利尔康消毒科技股份有限公司生产，生产批号：1304198； 苯酚，国药集团化学试剂有限公司，生产批号： 20120315。设置成6～7个浓度梯度（表2）。

表2 不同消毒剂等药物试验用量

1.4 卵囊孢子化试验

将富集到的新鲜卵囊加入一定量的超纯水进行倍比稀释， 然后取混匀后稀释液1 mL， 加入9 mL饱和食盐水中混匀，用胶头滴管将匀液注入麦克马斯特计数板的小室内， 静置5 min。在生物显微镜下（100×）统计卵囊数量。若10 mL饱和食盐水中卵囊总数为N， 按照公式N=［（n1+n2）/（2×0.15）］×10计算（每片计数室中的容积1 cm×1 cm×0.15 cm=0.15 cm3）。为减少误差，应确保每毫升卵囊数为1 000个以上。取1 mL卵囊液装入10 mL离心管中，加纯水离心，去上清。在离心管加入不同浓度梯度的药物1 mL，消毒剂组在室温下分别作用1 h，2 h，4 h，抗球虫药物组在室温下分别作用4 h， 6 h， 8 h。卵囊在室温下经药物作用后，加入清水3 000 r/min离心4次，洗去离心管中药物，加入质量分数2.5%重铬酸钾，120 r/min、28 ℃置于摇床上进行培养。分别在12 h，24 h，36 h，48 h，60 h，72 h统计兔球虫卵囊的孢子化率。在设定时间段用胶头滴管对离心管中溶液吹吸2次，混匀， 取1～2滴于载玻片上， 盖上盖玻片， 生物显微镜（100×）统计卵囊孢子化率，油镜下观察拍照。

1.5 统计方法和判定标准

（1） 将卵囊内部清晰可见内、外残体，斯氏体作为球虫卵囊孢子化评价标准，卵囊孢子化率=孢子化卵囊数/观测总卵囊数；孢子化抑制率=（观测抑制率-对照组抑制率）/（ 1-对照组抑制率）； （2） 用SPSS16.0的probit模板分析药物的半数孢子化时间EH50和半数效量EC50，将兔球虫卵囊的半数孢子化时间EH50和药物半数效量EC50作为药物效价的评判标准； （3） 随机以各药物组中100个孢子化卵囊为一组，观察4组，以不同种类兔球虫卵囊所占比例，作为该类卵囊耐药性的评价标准。

2 结果

2.1 抗球虫药物对卵囊孢子化影响

兔球虫卵囊经抗球虫药物作用不同时间后，摇床培养72 h，观测兔球虫卵囊孢子化抑制率，并经对照组数据校正（表3）。

表3 抗球虫药物对卵囊孢子化影响

2.1.1 球抑 兔球虫卵囊经不同浓度组球抑分别作用不同时间后，纳格浦尔艾美耳球虫卵囊受药物浓度和作用时间影响最小，穿孔艾美耳球虫在各药物组中卵囊孢子化比例都很高，均在25.75%以上，新兔艾美耳球虫、肠型艾美耳球虫、盲肠艾美耳球虫及松林艾美耳球虫卵囊随着药物浓度和作用时间改变，卵囊的孢子化过程也先后受到抑制。

2.1.2 优求乐 作用卵囊4 h， 大型艾美耳球虫卵囊孢子化比例在各药物组中均较高，仅次于穿孔艾美耳球虫和纳格浦尔艾美耳球虫。作用卵囊6 h后，穿孔艾美耳球虫卵囊孢子化在浓度15 g/L中孢子化比例为28.75%，其余药物浓度孢子化比例均维持在30%以上。作用卵囊8 h后，穿孔艾美耳球虫随着药物浓度增大，孢子化比例下降至25%以下。

2.1.3 百球清 作用卵囊4 h，穿孔艾美耳球虫卵囊孢子化比例随着药物浓度增大而减小，药物浓度为15 mL/L时，卵囊孢子化比例不到30%。百球清作用卵囊6 h，松林艾美耳球虫、维氏艾美耳球虫及中型艾美耳球虫卵囊孢子化受到抑制的浓度分别为0.5 mL/L、7.5 mL/L和15 mL/L。百球清各浓度作用卵囊8 h后对孢子化过程的影响与作用6 h的效果无明显差异。

2.1.4 球肠清 作用卵囊4 h， 穿孔艾美耳球虫卵囊孢子化比例在各浓度组中维持在30%以上。作用卵囊6 h，浓度在5 g/L时，穿孔艾美耳球虫卵囊孢子化比例小于30%，浓度为15 g/L时，中型艾美耳球虫与无残艾美耳球虫卵囊孢子化受到抑制。作用卵囊8 h，穿孔艾美耳球虫于1 g/L，随着药物浓度增大，卵囊孢子化比例下降。

2.1.5 肠球双效 作用卵囊4 h，60 g/L的药物浓度对松林艾美耳球虫卵囊孢子化起到抑制作用，其余药物浓度均不能完全抑制卵囊孢子化。穿孔艾美耳球虫卵囊在该浓度下孢子化比例较高，达35%。若药物作用时间增加至8 h，孢子化比例35%的药物作用浓度降至10 g/L。

2.2 消毒剂对兔球虫卵囊孢子化影响

兔球虫卵囊经消毒剂等5种药物作用不同时间后，摇床培养72 h，观测兔球虫卵囊孢子化抑制率，并经对照组数据校正（表4）。

表4 消毒剂对兔球虫卵囊孢子化影响

2.2.1 氨水 作用卵囊1 h，体积分数8%的氨水对松林艾美耳球虫卵囊孢子化起到完全抑制； 体积分数为20%时，能完全抑制维氏艾美耳球虫与无残艾美耳球卵囊孢子化。作用卵囊2 h，体积分数8%的氨水对肠型艾美耳球虫卵囊孢子化受到完全抑制；体积分数为20%时，盲肠艾美耳球虫与中型艾美耳球虫卵囊孢子化受到完全抑制。穿孔艾美耳球虫卵囊孢子化比例在氨水各体积分数中均维持在25%以上。作用卵囊4 h， 体积分数为8%时， 盲肠艾美耳球虫、松林艾美耳球虫和中型艾美耳球虫卵囊孢子化受到完全抑制； 当体积分数为10%时， 无残艾美耳球虫卵囊孢子化受到完全抑制； 体积分数为20%时， 仅穿孔艾美耳球虫、大型艾美耳球虫、纳格浦尔艾美耳球虫和微小艾美耳球虫卵囊发生孢子化。2.2.2 碘酊 作用卵囊1 h， 体积分数8%的碘酊浓度能完全抑制肠型艾美耳球虫卵囊孢子化，而穿孔艾美耳球虫卵囊孢子化比例最高，达34.50%； 体积分数为16%时，松林艾美耳球虫卵囊孢子化受到完全抑制； 当碘酊体积分数增大至30%时，中型艾美耳球虫与无残艾美耳球虫卵囊孢子化可完全抑制。作用卵囊2 h， 体积分数为16%时， 松林艾美耳球虫卵囊孢子化受到完全抑制，当碘酊体积分数增大至30%时， 中型艾美耳与无残艾美耳球虫卵囊孢子化受到完全抑制。作用卵囊4 h，体积分数为8%时， 无残艾美耳球虫卵囊孢子化受到完全抑制； 体积分数为16%时， 松林艾美耳球虫卵囊孢子化受到完全抑制； 体积分数为20%时， 穿孔艾美耳球虫卵囊孢子化比例最低至25%； 当体积分数增大至30%，仅穿孔艾美耳球虫、纳格浦尔艾美耳球虫、大型艾美耳球虫和斯氏艾美耳球虫卵囊发生孢子化。

2.2.3 二硫化碳 作用卵囊1 h， 体积分数为1%的二硫化碳可完全被抑制肠型艾美耳球虫与松林艾美耳球虫卵囊的孢子化过程，而穿孔艾美耳球虫卵囊孢子化比例高达40%；体积分数为6%时，仅穿孔艾美耳球虫、纳格浦尔艾美耳球虫、大型艾美耳球虫和微小艾美耳球虫卵囊发生孢子化。作用卵囊2 h， 体积分数为0.5%时，松林艾美耳球虫卵囊孢子化受到完全抑制； 体积分数为6%时， 斯氏艾美耳球虫卵囊孢子化受到完全抑制。作用卵囊4 h，体积分数为2%时，纳格浦尔艾美耳球虫、穿孔艾美耳球虫、大型艾美耳球虫和微小艾美耳球虫卵囊仍有发生孢子化。

2.2.4 苯酚 作用卵囊1 h， 体积分数为4%的苯酚能完全抑制新兔艾美耳球虫卵囊孢子化；体积分数为10%时，盲肠艾美耳球虫、维氏艾美耳球虫和中型艾美耳球虫卵囊孢子化受到完全抑制。作用卵囊2 h，体积分数为4%时，无残艾美耳球虫卵囊孢子化受到完全抑制，斯氏艾美耳球虫卵囊孢子化比例达10%； 当苯酚体积分数增大至10%时，能完全抑制兔球虫卵囊孢子化。作用卵囊4 h，体积分数为4%时，维氏艾美耳球虫与无残艾美耳球虫卵囊孢子化受到完全抑制； 体积分数为10%时，能完全抑制所有兔球虫卵囊孢子化。

2.2.5 三氯异氰尿酸 作用卵囊1 h， 浓度为40 g/L时，穿孔艾美耳球虫卵囊孢子化比例大于40%。作用卵囊2 h，浓度为10 g/L时，穿孔艾美耳球虫卵囊孢子化比例达35%，随着药物浓度增大，孢子化比例呈下降趋势； 作用卵囊4 h，无残与维氏艾美耳球虫卵囊孢子化分别在30 g/L与40 g/L时卵囊孢子化受到完全抑制。

3 讨论

3.1 抗球虫药物及消毒剂对兔球虫卵囊孢子化的抑制效果

通过试验发现， 抗球虫药物对兔球虫卵囊体外作用后的孢子化过程抑制效果欠佳， 消毒剂具有很好的抑杀效果。抗球虫药物体外作用8 h， 以15 mL/L百球清对兔球虫卵囊孢子化抑制效果最强。消毒剂中二硫化碳抑制兔球虫卵囊孢子化效果最好，6%的二硫化碳浓度作用于卵囊4 h，能完全抑制兔球虫卵囊的孢子化过程。5种药物对兔球虫卵囊孢子化抑制率大小依次为： 百球清＞优求乐＞球抑＞球肠清＞肠球双效，抗球虫药物半数效量大小依次为： 肠球双效＞球肠清＞球抑＞优求乐＞百球清。5种消毒剂药物对兔球虫卵囊孢子化抑制率大小依次为： 二硫化碳＞苯酚＞氨水＞三氯异氰尿酸＞碘酊； 消毒剂半数效量大小依次为： 碘酊＞三氯异氰尿酸＞氨水＞苯酚＞二硫化碳； 半数孢子化时间大小依次为： 二硫化碳＞苯酚＞氨水＞三氯异氰尿酸＞碘酊。

3.2 兔球虫卵囊大小与消毒剂作用下孢子化率关系

本试验研究表明， 在各类药物不同浓度作用不同时间后，纳格浦尔艾美耳球虫卵囊受药物浓度和作用时间影响较小，可见纳格浦尔艾美耳球虫卵囊耐药性较强。当8%二硫化碳作用兔球虫卵囊2 h时，仅穿孔艾美耳球虫与纳格浦尔艾美耳球虫卵囊发生孢子化，纳格浦尔艾美耳球虫卵囊孢子化比例为96%，穿孔艾美耳球虫卵囊孢子化比例为4%，穿孔艾美耳球虫卵囊耐药性仅次于纳格浦尔艾美耳球虫。体积分数为20%氨水作用卵囊1 h后，仅穿孔艾美耳球虫、纳格浦尔艾美耳球虫、微小艾美耳球虫和大型艾美耳球虫卵囊发生孢子化，其中微小艾美耳球虫和大型艾美耳球虫卵囊孢子化比例分别为16.25%与6.5%，可见微小艾美耳球虫卵囊对该药物抵抗能力要强于大型艾美耳球虫卵囊。穿孔艾美耳球虫，纳格浦尔艾美耳球虫与微小艾美耳球虫卵囊体积较小， 平均长度均在25 μm以下， 其余艾美耳球虫卵囊长度均大于25 μm。通过对比表明，体积越小的兔球虫卵囊越容易发生孢子化， 对药物抵抗能力越强，而体积越大的兔艾美耳球虫卵囊孢子化越易受到药物影响，不容易发生孢子化。

3.3 氨水评价几种兔球虫卵囊的耐药性

对比毒力较强艾美耳球虫卵囊孢子化抑制率发现， 4%氨水作用4 h， 毒力极强的肠型艾美耳球虫卵囊发生孢子化比例为2.75%； 8%氨水作用4 h，毒力较强的无残艾美耳球虫卵囊孢子化比例为2.00%；10%氨水作用4 h， 除毒力较强的大型艾美耳球虫卵囊仍有发生孢子化外，毒力最强的斯氏艾美耳球虫卵囊孢子化比例降为2.75%； 20%氨水作用4 h，毒力较强的大型艾美耳球虫卵囊孢子化比例为6.5%，其余毒力较强的艾美耳球虫卵囊孢子化均受到完全抑制。可见，毒力较强的兔球虫卵囊耐药性大小依次为： 大型艾美耳球虫＞斯氏艾美耳球虫＞无残艾美耳球虫＞肠型艾美耳球虫。在兔球虫净化过程中，应注意抗球虫药物和消毒剂的选择，将抑杀重点放在毒力较大且耐药性较强的卵囊上。

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Effects of Different Drugs and Disinfectants on Sporulation of Coccidian Oocysts in Rabbit

WEN Fu-li1， ZHANG Jia2， ZHENG He-ping1， MA Lei1， ZHANG Shi-lan1， WANG Shou-kun2
（1.Department of Comparative Medicine， Fuzhou General Hospital of Nanjing Command，PLA， Fuzhou 350025， China； 2.College of Animal Science，Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China）

Objective To study inhibitory effect of different drugs and disinfectants on coccidian oocyst sporulated in rabbit， and to provide reference for the prevention and treatment of rabbit coccidiosis.Methods Selected 5 kinds of drugs and disinfectant for gradient test， respectively.To observe their effects on sporulation process of rabbit coccidia oocysts in vitro.Results （1） Inhibition test was performed under 5 kinds of anticoccidial drugs.The drugs of inhibition rate for coccidian oocyst sporulated were shown in turns： Toltrazuril Solution ＞ Decoquinate Premix ＞ Dinitolmide Premix ＞ Diclazuril Premix ＞ Amprolium Hydrochloride and sulfaquioxaline Sodium.The median effect concentration （EC50）were shown as follows： Amprolium Hydrochloride and sulfaquioxaline Sodium ＞ Diclazuril Premix ＞Dinitolmide Premix ＞ Decoquinate Premix ＞ Toltrazuril Solution.Take 15 mL/L Toltrazuril Solution effect of 8h has the strongest inhibitory on the sporulation of rabbit coccidian oocysts.（2） The rate of 5 kinds of disinfectants which inhibit rabbit coccidian oocyst from being sporulated was shown as follows：Carbon disulfide ＞ Phenol ＞ Ammonia ＞ Symclosene ＞ Tincture of iodine.The EC50were shown as follows：Tincture of iodine ＞ Symclosene ＞ Ammonia ＞ Phenol ＞ Carbon disulfide.The hours for 50% of maximal effect （EH50） were shown as follows：Carbon disulfide ＞ Phenol ＞ Ammonia ＞ Symclosene ＞Tincture of iodine.（3） The drug resistance of rabbit coccidiosis oocysts with strong toxicity were shown as follows： E.magna ＞ E.stieda ＞ E.irresidu ＞ E.intestinal.Conclusions The 15 mL/L toltrazuril solution with effect of 8 h has the strongest inhibitory on the sporulation of rabbit coccidian oocysts.Carbon disulfide at concentration of 6% with effect of 4 h can completely inhibit rabbit coccidian oocysts from being sporulated.Drug resistance to rabbit coccidia oocysts was associated with body size of the parasite， and the larger body size with high sensitivity.

Rabbit； Coccidiosis； Anticoccidial drugs； Disinfectants； Sporulated oocysts

R332， Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0301-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.011

2016-05-30

福建省科技计划引导性项目（2015Y0075）和南京军区福州总医院临床应用研究专项（2015L01）

温福利（1987-）， 男， 技师， 主要从事实验动物寄生虫研究。E-mail： wen_fuli@163.com

王寿昆（1956-）， 男， 汉族， 教授， 主要从事兽医寄生虫方面的研究。E-mail： wsk138@163.com