毒害与巨型及毒害与柔嫩艾美耳球虫间在免疫方面的相互影响

李建梅，刘 梅，戴亚斌，陶建平

(1.中国农业科学院 家禽研究所，江苏 扬州 225125；2.扬州大学 兽医学院，江苏 扬州 225009)

鸡球虫病是一种危害严重的鸡肠道寄生虫病，对世界范围的养禽业造成了严重经济损失[1]。目前，鸡球虫病病原主要有堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、缓艾美耳球虫(E.mitis)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、早熟艾美耳球虫(E.praecox)和柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)7 种，其中柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫的致病性最强，堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫具有中等强度的致病性[2-3]。在自然情况下，鸡球虫病往往呈多种球虫混合感染[4]。传统治疗鸡球虫病的方法主要依靠磺胺类化学药物，但随着人们对肉蛋中药物残留问题的日益关注以及鸡球虫耐药虫株的不断出现，不少抗球虫药在国际上已开始列为禁用药，使得药物防治面临困境，这就迫使人们将目光转向免疫预防等替代途径来防控鸡球虫病[5]。目前，临床上使用的鸡球虫病疫苗多数是由数种鸡球虫组成的活虫苗，有些种类在鸡肠道内的寄生部位相同，如毒害艾美耳球虫在裂殖生殖阶段与巨型艾美耳球虫寄生部位相同，而在配子生殖阶段与柔嫩艾美耳球虫的寄生部位又相同，这种相同的寄生部位在免疫上是否会相互影响。为此，本研究探索了毒害与巨型及毒害与柔嫩艾美耳球虫间在免疫上的相互影响，为今后鸡球虫病的免疫预防奠定基础。

1 材料和方法

1.1 虫 株 毒害艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫南通株均为田间分离株，由扬州大学寄生虫教研室分离保存，实验前均经鸡体传代复壮。

1.2 实验动物及主要试剂 苏禽黄羽肉鸡购自中国农业科学院家禽研究所育种中心，出壳后运回实验室，饲养在无球虫的环境中，饲喂不含任何抗球虫药的全价饲料。实验开始前，采用常规方法镜检有无球虫卵囊，确认无球虫卵囊污染后，方可用于实验。辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG(IgG-HRP)购自HPL 公司。

1.3 实验设计 挑选体况相近的5 日龄黄羽肉鸡132 只，分成11 组，每组12 只。免疫和攻虫途径均采用嗉囊接种途径，实验设计和免疫程序见表1，其中未免疫攻虫组免疫时以及阴性对照组免疫和攻虫时每次接种1 mL PBS。二免前和攻虫前每组随机取5 只鸡，无菌心脏采血1 mL，分离血清，用于检测其抗球虫的抗体水平。

表1 实验分组与免疫程序Table 1 Groups and immunization schedules

1.4 临床观察 攻虫后观察鸡的精神状态、饮欲食欲、粪便与发病情况。攻虫后第8 d 结束实验，以平均增重、死亡率、平均肠道病变记分等作为实验指标。

1.5 卵囊计数 参照文献[6]的方法，即攻虫后第6 d 起每12 h 收集各组鸡的全部粪便样品，搅拌后稀释至1 000 mL，吸取10 个1 mL 置于小烧杯内，加1 mL 次氯酸钠溶液作用2 h 后，加饱和食盐水定容至60 mL，先用60 目铜筛过滤，滤液用麦克马斯特法进行卵囊计数，计算出每只鸡的总排卵囊量。

1.6 免疫保护效果评价指标(1)死亡率(%)：死亡鸡数/开始鸡数×100 %；(2)相对增重率(%)：免疫攻虫组或未免疫攻虫组鸡的平均增重/未免疫未攻虫组鸡的平均增重×100 %。其中：①平均增重1=攻虫时重-首次免疫时体重；②相对增重率1=(实验组增重/未免疫未攻虫组增重)×100 %；③平均增重2=宰杀时重-攻虫时重；④相对增重率2=(实验组增重/未免疫未攻虫组增重)×100 %；(3)相对卵囊产量：相对卵囊产量=(实验组排出卵囊数/未免疫攻虫组排出卵囊数)×100 %；(4)卵囊减少率：卵囊减少率=(未免疫攻虫组排卵囊数-免疫攻虫组排卵囊数)/未免疫攻虫组排卵囊数；(5)病变记分：平均肠道病变记分参照Johnson 和Reid[7]的标准。

1.7 血清抗体水平检测 采用间接ELISA 法进行血清抗体水平检测，即采用JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎仪裂解各球虫孢子化卵囊，4 ℃12 000 r/min 离心15 min 取上清，获取纯化蛋白，以其为抗原包被96 孔板，加入稀释后的待检血清100 μL/孔，37 ℃温育2 h，以羊抗鸡IgG-HRP(1∶1 000)为二抗，OPD底物显色，利用酶标仪测定OD490nm值。

1.8 数据处理与分析 利用SPSS 软件对实验数据进行一维方差描述性统计分析，并用Duncan 氏新复极差法对组间平均值进行多重比较(p<0.05)。

2 结果

2.1 临床观察结果

2.1.1 非免疫攻虫组 各非免疫攻虫组实验鸡在攻虫后第4 d 起分别出现临床症状。非免疫攻柔嫩艾美耳球虫组最先表现出临床症状，排鲜红色血便，第5 d 血便达到高峰，第6 d 开始出现死亡，剖检死亡鸡其盲肠外观肿大呈暗红色、肠腔内充满红色血液和脱落的黏膜碎片。

非免疫攻毒害艾美耳球虫组第5 d 开始排酱油色血便，有的血便周围有乳白色油状物，第6 d 开始出现死亡，剖检死亡鸡，发现整个小肠段肿大，尤其是卵黄蒂前后，浆膜面可见针尖状出血点和小白斑，肠壁菲薄呈红色或粉红色，肠腔内混有较多血凝块和脱落的肠黏膜。

非免疫攻巨型艾美耳球虫组也于第5 d 开始出现症状，排出典型的棉线样稀粪，第6 d 开始出现死亡，剖检死亡鸡小肠段出现肿胀、肠内容物稀薄呈粘稠状米黄色、黏膜水肿增厚并伴有少量出血点。

2.1.2 免疫攻虫组 毒害艾美耳球虫与巨型艾美耳球虫混合免疫组，攻毒害艾美耳球虫后第6 d 开始出现血便，并有2 只鸡死亡，而攻巨型艾美耳球虫组仅出现粪便变稀；毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫混合免疫组，分别攻毒害艾美耳球虫或柔嫩艾美耳球虫后均有血便出现，但前者的血便数明显多于后者，并且有1 只鸡攻毒害艾美耳球虫后死亡；毒害艾美耳球虫单独免疫组攻虫后出现的血便数较柔嫩艾美耳球虫单独免疫组攻虫后的要多，并且前者有1 只鸡在攻毒害艾美耳球虫后第7 d 死亡；巨型艾美耳球虫单独免疫组攻虫后粪便只是略显稀薄，不排血便。

2.2 死亡率和平均肠道病变记分 攻毒害艾美耳球虫后，毒害艾美耳球虫与巨型艾美耳球虫混合免疫组、毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫混合免疫组及毒害艾美耳球虫单独免疫组均出现死亡，但死亡率明显低于非免疫攻毒害艾美耳球虫组。同时，毒害艾美耳球虫单独免疫组死亡率虽低于混合免疫组，但差异不显著(p>0.05)。非免疫攻毒害艾美耳球虫组病变记分显著高于免疫攻虫组(p<0.05)，其中毒害艾美耳球虫单独免疫组的病变记分高于混合免疫组，但无显著差异(p>0.05)(表2)，表明混合免疫组对毒害艾美耳球虫的免疫保护效果优于毒害艾美耳球虫单独免疫组。

攻巨型艾美耳球虫后，毒害艾美耳球虫与巨型艾美耳球虫混合免疫组及巨型艾美耳球虫单独免疫组均未出现死亡。免疫攻虫组病变记分显著小于非免疫攻巨型艾美耳球虫组(p<0.05)，其中巨型艾美耳球虫单独免疫组病变记分为零(表2)，表明巨型艾美耳球虫单独免疫组对巨型艾美耳球虫的免疫保护效果优于混合免疫组。

攻柔嫩艾美耳球虫后，毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫混合免疫组及柔嫩艾美耳球虫单独免疫组死亡率均为零。免疫攻虫组病变记分显著小于非免疫攻柔嫩艾美耳球虫组(p<0.05)，其中柔嫩艾美耳球虫单独免疫组病变记分略高于混合免疫组，但无显著差异(p>0.05)(表2)，表明柔嫩艾美耳球虫单独免疫组对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护效果与混合免疫组相比差异不大。

2.3 增重情况 免疫后各实验组平均增重与未免疫未攻虫组相比无明显差异(p<0.05)，各免疫组相对增重率均在90 %以上(表3)。

攻毒害艾美耳球虫后，毒害艾美耳球虫与巨型艾美耳球虫混合免疫组、毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫混合免疫组平均增重与毒害艾美耳球虫单独免疫组、未免疫攻毒害艾美耳球虫组相比差异显著(p<0.05)，其中毒害艾美耳球虫与巨型艾美耳球虫混合免疫组与未免疫未攻虫组相比差异不显著(p>0.05)，而毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫混合免疫组及毒害艾美耳球虫单独免疫组与未免疫未攻虫组相比差异显著(p<0.05)。毒害艾美耳球虫单独免疫组相对增重率明显低于混合免疫组，但仍高于未免疫攻毒害艾美耳球虫组(表3)。表明毒害艾美耳球虫与巨型艾美耳球虫混合免疫组对毒害艾美耳球虫的免疫保护效果最好，毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫混合免疫组次之，毒害艾美耳球虫单独免疫组最差。

攻巨型艾美耳球虫后，毒害艾美耳球虫与巨型艾美耳球虫混合免疫组、巨型艾美耳球虫单独免疫组平均增重显著高于未免疫攻巨型艾美耳球虫组(p<0.05)，而与未免疫未攻虫组相比差异不显著(p>0.05)，其相对增重率均在95.00 %以上(表3)。表明混合免疫组对巨型艾美耳球虫的免疫保护效果略低于巨型艾美耳球虫单独免疫组。

攻柔嫩艾美耳球虫后，毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫混合免疫组、柔嫩艾美耳球虫单独免疫组平均增重显著高于未免疫攻柔嫩艾美耳球虫组(p<0.05)，而与未免疫未攻虫组相比差异不显著(p>0.05)，其相对增重率均在79.00 %左右(表3)。表明混合免疫组和柔嫩艾美耳球虫单独免疫组对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护效果相当。

表2 各实验组鸡病死率、平均肠道病变记分及卵囊产量Table 2 The mortality,mean intestinal lesion score and oocyst production of each group

表3 各实验组鸡增重情况Table 3 Weight gain of each group post-challenge

2.4 卵囊产量、相对卵囊产量与卵囊减少率 除未免疫未攻虫组外，各实验组鸡均有不同数量的卵囊排出，其中以未免疫攻巨型艾美耳球虫组、未免疫攻柔嫩艾美耳球虫组排出的卵囊数量最多，而未免疫攻毒害艾美耳球虫组鸡因发病而在未形成卵囊时就已经大量死亡，存活的鸡也由于该球虫对其肠道造成的严重损伤而形成卵囊的数量较少，因而卵囊产量与其它组相比明显要少，其卵囊产量甚至比毒害艾美耳球虫单独免疫组的要低(表2)。

攻虫后，除毒害艾美耳球虫单独免疫组外，各免疫组卵囊产量、相对卵囊产量均低于各未免疫攻虫组。另外，毒害艾美耳球虫与巨型艾美耳球虫混合免疫组、毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫混合免疫组及毒害艾美耳球虫单独免疫组攻毒害艾美耳球虫后卵囊减少率均较低，毒害艾美耳球虫单独免疫组为负值；毒害艾美耳球虫与巨型艾美耳球虫混合免疫组和巨型艾美耳球虫单独免疫组攻巨型艾美耳球虫后卵囊减少率分别为93 %和100 %；毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫混合免疫组和柔嫩艾美耳球虫单独免疫组攻柔嫩艾美耳球虫后卵囊减少率分别为89.61 %和82.79 %(表2)。表明混合免疫组对毒害艾美耳球虫或柔嫩艾美耳球虫的免疫保护效果优于毒害艾美耳球虫单独免疫组和柔嫩艾美耳球虫单独免疫组，而对巨型艾美耳球虫的免疫保护效果低于巨型艾美耳球虫单独免疫组。

2.5 血清抗体水平 采用间接ELISA 法分别测定各实验组鸡一免后和二免后的抗体水平，分析毒害与巨型及毒害与柔嫩艾美耳球虫间在免疫上的相互影响。

2.5.1 毒害艾美耳球虫与巨型艾美耳球虫间的相互影响 一免后混合免疫组与巨型艾美耳球虫单独免疫组间的抗巨型艾美耳球虫抗体水平无显著差异(p>0.05)；二免后巨型艾美耳球虫单独免疫组抗体水平显著高于混合免疫组(p<0.05)(表4)。二免后混合免疫组抗体水平与一免时相比均有所下降，而巨型艾美耳球虫单独免疫组抗体水平则比一免时要高。表明毒害艾美耳球虫干扰了巨型艾美耳球虫抗体的生成。

表4 毒害艾美耳球虫对巨型艾美耳球虫抗体水平的影响Table 4 The immune interaction between E.necatrix and E.maxima

一免后混合免疫组与毒害艾美耳球虫单独免疫组间抗毒害艾美耳球虫抗体水平差异不显著(p>0.05)；二免后混合免疫组抗体水平显著高于毒害艾美耳球虫单独免疫组(p<0.05)(表5)。二免后各免疫组抗体水平较一免时均有所下降，但混合免疫组抗体水平在一免和二免后均高于毒害艾美耳球虫单独免疫组。表明巨型艾美耳球虫对毒害艾美耳球虫抗体的生成存在免疫协同效应。

2.5.2 毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫间的相互影响 一免和二免后混合免疫组与柔嫩艾美耳球虫单独免疫组间抗柔嫩艾美耳球虫抗体水平差异不显著(p>0.05)(表6)。二免后各免疫组的抗体水平均增加。表明毒害艾美耳球虫对柔嫩艾美耳球虫抗体的生成无干扰。

一免后混合免疫组与毒害艾美耳球虫单独免疫组间抗毒害艾美耳球虫抗体水平差异不显著(p>0.05)。二免后混合免疫组抗体水平显著高于毒害艾美耳球虫单独免疫组(p<0.05)(表7)。二免后毒害艾美耳球虫单独免疫组抗体水平与一免时相比迅速下降，而混合免疫组一免和二免后的抗体水平变化不大。表明柔嫩艾美耳球虫对毒害艾美耳球虫抗体的生成存在免疫协同效应。

表5 巨型艾美耳球虫对毒害艾美耳球虫抗体水平的影响Table 5 The immune interaction between E.necatrix and E.maxima

表6 毒害艾美耳球虫对柔嫩艾美耳球虫抗体水平的影响Table 6 The immune interaction between E.necatrix and E.tenella

表7 柔嫩艾美耳球虫对毒害艾美耳球虫抗体水平的影响Table 7 The immune interaction between E.necatrix and E.tenella

3 讨论

本研究结果显示毒害艾美耳球虫与巨型艾美耳球虫混合免疫对毒害艾美耳球虫的免疫保护效果比毒害艾美耳球虫单独免疫好，而对巨型艾美耳球虫的免疫保护力则略低于巨型艾美耳球虫单独免疫，但仍具有免疫保护性；毒害艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫混合免疫对毒害艾美耳球虫的免疫保护效果优于毒害艾美耳球虫单独免疫，而对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护力与柔嫩艾美耳球虫单独免疫相比差异不大。原因可能是毒害艾美耳球虫致病性很强，免疫原性相对较弱，并且裂殖生殖阶段与巨型艾美耳球虫寄生部位相同，二者之间存在一定的竞争关系，从而对同源攻击缺乏抵抗力，而柔嫩艾美耳球虫则是在有性生殖阶段与毒害艾美耳球虫寄生部位相同。

临床症状、平均肠道病变记分、死亡率、增重、卵囊减少率等结果表明巨型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫均具有良好的免疫原性，而毒害艾美耳球虫的免疫原性较差。这与Talebi 等认为的巨型艾美耳球虫是鸡体内致病性球虫中免疫原性最强的球虫之一的结论相符[8]，同时也支持陶建平等认为的巨型艾美耳球虫南通株的免疫原性最广谱，可用作疫苗候选株的结论[6]。Chapman 等认为毒害艾美耳球虫的免疫原性在鸡的7 种球虫中最弱[9]，本研究也证实了这一结论。这一研究结果表明在鸡球虫的免疫研究中，不同种球虫的抗原存在差异，同种不同株间的抗原也存在差异，同一个体的不同发育阶段抗原也不尽相同[10]。

根据ELISA 检测结果显示毒害艾美耳球虫单独免疫后抗体水平上升较快，但持续时间短，很快下降。这与卞国志等认为的雏鸡口服免疫接种一定剂量毒害艾美耳球虫孢子化卵囊后可迅速诱导鸡体产生特异性免疫力，但免疫保护力在笼养条件下持续时间较短的结论一致[11]。

迄今为止，很多国内外学者认为由T 淋巴细胞、NK 细胞、巨噬细胞介导的细胞免疫在鸡球虫病的保护性免疫应答中起重要做用[12]，但在球虫感染期间特异性循环抗体和sIgA 的出现，以及从鸡高免血清中分离出的丙球蛋白可与相应球虫子孢子、成熟裂殖体及配子体发生特异免疫荧光反应，提示体液免疫在抗球虫免疫研究中也发挥着十分重要的作用[13]。同时鸡球虫免疫血清还可作为一种有用的诊断工具来确定艾美耳球虫在鸡群中或单个鸡中的存在情况，或是用于对鸡球虫疫苗免疫程序的监测[14]。因此，本研究利用ELISA 法监测各个艾美耳球虫抗体与相应抗原之间的免疫应答效应，但发现免疫鸡卵囊排出量与抗体水平之间缺乏联系，这一研究结果与Talebi 等的研究结果相一致[8]。

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