1型糖尿病小鼠骨髓EPCs的培养和功能研究

覃　媛　蔡　轶　张　曼　赵　莉广州医科大学药学院蛇毒与生物毒素研究所，广东广州　511436

1型糖尿病小鼠骨髓EPCs的培养和功能研究

覃媛蔡轶张曼赵莉
广州医科大学药学院蛇毒与生物毒素研究所，广东广州511436

目的 研究1型糖尿病小鼠骨髓内皮祖细胞（EPCs）的培养方法和血管原性功能。方法 采用7～8周雄性C57/B6小鼠，腹腔注射链脲佐菌素建立1型糖尿病小鼠模型，同时设立正常对照组，连续5 d给等量的柠檬酸缓冲液。采用密度梯度离心法分离并培养糖尿病小鼠骨髓EPCs；通过MTT法、Matrigel、改良Boyden小室分别检测EPCs的增殖、迁移和小管形成的功能性指标。结果 与正常对照组比较，培养获得1型糖尿病小鼠的EPCs增殖减少，其迁移和小管形成能力明显下降（P＜0.05）。结论 成功培养1型糖尿病小鼠骨髓EPCs，EPCs的血管原功能受损。

1型糖尿病；内皮祖细胞；增殖；迁移；小管形成

［Abstract］Objective To study the culture and biological function of bone marrow endothelial progenitor cells（EPCs）in type 1 diabetic mice.Methods C57/B6 male mice with 7-8 weeks old were intraperitoneal injected Streptozotocin to establish type 1 diabetic mice model.While normal control group was set up，and was given the same amount of citric acid buffer for 5 day.EPCs were isolated and cultured by density gradient method from diabetic mice.EPC proliferation were evaluated by using the MTT colorimetric assay.EPC migration was measured by transwell method.EPC tube formation ability was estimated by Matrigel.Results Compared with control mice，the proliferation，migration and tube formation of diabetic EPCs were deceased（P＜0.05）.Conclusion Bone marrow endothelial progenitor cells in type 1 diabetic mice were successfully cultured，and the function of diabetic EPCs was impaired.

［Key words］Type 1 diabetes mellitus；Endothelial progenitor cells；Proliferation；Migration；Tube formation

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一类能增殖分化为血管内皮细胞的前体细胞。自Asahara首次从循环外周血中分离出能分化为成熟血管内皮细胞的EPCs后，越来越多的报道证实EPCs可在成年组织中修复受损的血管内皮，且参与生理性和病理性的血管新生［1-3］。糖尿病血管病变是糖尿病的主要并发症，近年大量研究发现糖尿病EPCs的数量和功能改变与血管并发症的关系密切［4-5］。因此糖尿病EPCs成为人们研究的一个热点。近年国内对EPCs进行了许多研究报道［6-8］，但有关1型糖尿病EPCs的分离培养和功能研究报道极少。因此，本实验旨在建立1型糖尿病小鼠骨髓EPCs的培养方法，并观察1型糖尿病小鼠的EPCs增殖、迁移和小管形成等多种功能，为深入研究糖尿病EPCs的功能障碍奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

SPF级的C57/B6雄性小鼠（20～23 g）30只购自广东医学实验动物中心（4400720523）；异氟烷购自山东科源制药；淋巴细胞分离液、纤连蛋白、链脲佐菌素（STZ）购自美国Sigma公司；DiI-acLDL购自美国Molecular Probe公司；EGM-2培养基购自 Lonza公司。

1.2方法

1.2.1小鼠1型糖尿病模型的建立选用7～8周雄性C57/B6小鼠，连续5 d给予小鼠腹腔注射小剂量STZ 45 mg/（kg·d），正常对照组连续5 d给予等量的柠檬酸缓冲液。1周后测小鼠空腹血糖，连测3 d。空腹血糖高于16.7 nmol/L即确认为糖尿病小鼠。

1.2.2糖尿病骨髓EPCs的培养先用纤连蛋白包被细胞培养皿，置37℃孵育1 h后。取糖尿病7周小鼠消毒脱臼致死，取出四肢，剃除肌肉，将取出的骨头去除关节端，暴露骨髓腔；PBS冲洗收集细胞。于离心管加入淋巴细胞分离液5 mL，将细胞悬液加至分离液上层，密度梯度离心，直至骨髓腔液体分为四层。用吸管轻吸云雾状的白膜层即单个核细胞层，用含5%胎牛血清的EGM-2培养基，置37℃、5%CO2培养，取培养7 d的EPCs进行实验。

1.2.3EPCs的鉴定取培养第7天原代EPCs，经DiI-acLDL（2.4 μg/mL）及FITC-UEA-1（10 μg/mL）孵育，PBS洗涤后，在荧光显微镜下鉴定。

1.2.4EPCs的增殖用0.25%胰酶将 EPCs消化成单细胞悬液，以每孔100 μL接种于96孔培养板，每组设空白对照和6个复孔，48 h后加入MTT溶液培养4 h，吸弃上清后加入二甲基亚砜，在酶标仪于570 nm处测定各孔的吸光度值，实验重复3次，取均值。

1.2.5EPCs小管的形成将Matrigel胶4℃过夜冻融，在层流超净台上，Matrigel包被48孔培养板，并放置37℃，5%CO2环境下聚合30 min。用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化并收集贴壁细胞，每孔加入500 μL细胞悬液，37℃，5%CO2培养箱培养16 h。显微镜下观察管腔样结构并拍照，计数高倍镜下5个视野的管腔长度，实验重复3次，取均值。

1.2.6EPCs的迁移取培养7 d的小鼠骨髓EPCs，用0.25%胰酶 （含0.02%EDTA）消化并收集细胞。将100 μL细胞悬液缓慢加入Transwell小室的上室。将下室加入500 μL含10%胎牛血清的1640培养基。置于CO2培养箱中培养16 h，检测时移去上室培养液，100%甲醇固定，2.5 g/L结晶紫置于37℃暖箱染色30 min，显微镜下观察并拍照，计数高倍镜下5个视野的迁移细胞数，实验重复3次，取均值。

1.3统计学方法

采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1骨髓EPCs的形态

分离的单个核细胞72 h后呈梭形生长。第7天时，细胞生长旺盛，部分呈集落生长，中央细胞密集且呈复层生长，并由中央向外周伸展出梭形、纺锤形细胞，近似单层生长。培养14 d，细胞融合成铺路石内皮样细胞。见图1。

图1　骨髓来源小鼠内皮祖细胞的形态（100×）

2.2EPCs的鉴定

将培养的EPCs进行DiI-acLDL和FITC-UEA-1双荧光染色，UEA-1阳性显示绿色荧光，ac-LDL阳性显示红色荧光，EPCs双荧光阳性，显示橙黄色。见图2（封三）。

2.31型糖尿病小鼠EPCs的增殖

采用MTT比色法检测EPCs的增殖能力，1型糖尿病小鼠培养的EPCs增殖明显减少 （P＜0.05），较正常对照组减少约40%。见图3。

与Control比较，*P＜0.05，n=4图3　1型糖尿病小鼠内皮祖细胞的增殖能力

2.41型糖尿病小鼠EPCs小管的形成

用Matrigel建立小管形成的体外模型，计算形成的管腔长度。实验结果显示，与正常对照组比较，1型糖尿病小鼠的EPCs小管形成能力显著减弱（P＜0.05）。见图4。

与Control比较，*P＜0.05；n=4图4　1型糖尿病小鼠内皮祖细胞小管的形成能力（100×）

2.51型糖尿病小鼠的EPCs迁移能力

用改良的Boyden小室法检测细胞的迁移能力。结果显示，与正常对照组比较，糖尿病小鼠EPCs的迁移数量明显减少（P＜0.05）。见图5（封三）。

3　讨论

随着经济高速发展和人们生活方式的快速转变，我国糖尿病患者迅速增多，目前成人糖尿病患病率高达11.6%，保守估计约1.139亿人，已成为世界第一糖尿病大国［9］。糖尿病血管病变是糖尿病多种并发症的病理基础，采用EPCs替代受损的血管内皮细胞，掺入受损的血管进而修复血管功能，近年成为一个新的有希望的治疗策略。

EPCs主要定位于骨髓，在循环外周血中EPCs仅占单核细胞的0.1%［10］。骨髓中的EPCs含量相对丰富，增殖能力强，而外周血的EPCs数量很少，糖尿病患者的EPCs数量则更少。由于糖尿病EPCs的数量稀少，增殖能力减弱，成功培养糖尿病EPCs成为一个难点。因此本研究对从糖尿病小鼠的骨髓中分离培养出来的EPCs进行分析。

目前EPCs的鉴定标准未完全一致。一般通过细胞的形态、功能和表型多方面指标鉴定EPCs。综合现有文献，常用的鉴定方法是EPCs培养早期呈纺锤形，晚期呈铺路石内皮样，可摄取植物凝集素（UEA-1）和乙酰化低密度脂蛋白（acLDL），并表达内皮细胞和祖细胞的混合表型［11］。

本研究首先采用STZ建立1型糖尿病小鼠模型，STZ是N-乙酰葡糖胺的类似物，它由葡萄糖转运蛋白输送到胰腺β细胞，通过抑制β细胞的N-乙酰基-D-氨基葡萄糖苷酶的活性造成β细胞毒性，导致胰岛素缺乏［12］。C57/B6小鼠是STZ-诱导1型糖尿病的敏感品系小鼠，产生持续的高血糖症与组织学病变发展，已广泛应用于各种糖尿病并发症的研究［13-14］。首先将分离的骨髓单个核细胞用内皮细胞特定的培养基诱导培养，经DiI-acLDL和FITC-UEA-1双染法，双染细胞占贴壁细胞总数的80%以上，证实绝大多数贴壁细胞为EPCs，细胞形态和免疫鉴定都表明我们成功分离培养糖尿病小鼠骨髓EPCs。建立1型糖尿病小鼠后，本研究采用密度梯度离心方法分离获得糖尿病小鼠骨髓的单个核细胞，采用纤连蛋白黏附，用含有血管内皮生长因子等多种生长因子的EGM培养基进行诱导培养。第7天左右，细胞呈纺锤形，部分呈集落生长，中央细胞密集且呈复层生长，并由中央向外周伸展出梭形细胞。培养14 d，细胞融合成铺路石内皮样细胞。并经FITC-UEA-1和DiI-acLDL荧光双染法证实成功分离培养糖尿病小鼠骨髓EPCs。

EPCs具有增殖、迁移和血管形成能力，在环境诱导下骨髓中的EPCs可以自发地动员并结合到内皮缺损或缺血部位，在血管内皮的修复和血管新生中都起着重要作用［15-17］。然而大量临床研究报道，糖尿病患者的EPCs数量减少，并且血管原性功能发生障碍［18-19］。Loomans等［20］报道1型糖尿病患者比正常对照外周血中EPCs数目平均降低44%，而且EPCs数目减少的程度与HbA1C的水平呈正相关。Sorrentino等［21］将健康受试者和2型糖尿病患者分离的EPCs移植入裸鼠的颈动脉，糖尿病EPCs不能修复受损的动脉内皮层，而正常EPCs可改善受损的内皮。

本实验检测了1型糖尿病小鼠骨髓EPCs的体外功能。实验结果显示，糖尿病小鼠EPCs的增殖减少，迁移和小管形成能力显著下降，这与临床的研究结果相一致。足够的数量和正常的功能是影响EPCs参与修复内皮损伤的关键因素。而糖尿病患者循环EPCs数量显著减少，功能发生障碍，无法修复高血糖导致的内皮损伤。因此进一步阐明糖尿病EPCs功能障碍的机制，找到改善EPCs功能的策略，有望用于预防和治疗糖尿病血管并发症。

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Culture and biological function study of bone marrow endothelial progenitor cells in type 1 diabetic mice

QIN YuanCAI YiZHANG ManZHAO Li
Department of Pharmacology，Guangzhou Snake Venom and Biotoxin Research Institute，Guangzhou Medical University，Guangdong Province，Guangzhou511436，China

R587.1

A

1673-7210（2016）08（a）-0008-04

2016-04-20本文编辑:任念）

广东省自然科学基金项目（2016A030310271）；广州医科大学科学科研项目（2013C2205）。

覃媛（1978.2-），女，博士，实验师；研究方向:心血管药理。

赵莉（1979.1-），女，博士；研究方向:心血管及肿瘤药理。