基于三种体外抗氧化方法对白木香种子抗氧化能力的研究

周海玲　马　麟　易智彪.广州中医药大学第二附属医院药学部，广东广州　500；.东莞广州中医药大学中医药数理工程研究院，广东东莞　53808

基于三种体外抗氧化方法对白木香种子抗氧化能力的研究

周海玲1马麟1易智彪2
1.广州中医药大学第二附属医院药学部，广东广州510120；2.东莞广州中医药大学中医药数理工程研究院，广东东莞523808

目的 探究白木香种子的体外抗氧化能力。方法 预处理白木香种子并提取其黄酮成分；用铜离子还原法测定了其还原能力，采用2，2'-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）体系对其进行抗氧化活性的研究，并以抗坏血酸（VC）作比较。测定并计算其相对总还原百分率或清除率，以相对总还原百分率或清除率为纵坐标、样品液的浓度为横坐标作线性回归，从回归曲线的置信限制中找到概率为0.50的估算浓度即为半抑制浓度（IC50）。本研究所得数据全部采用统计学软件SPSS 19.0建模分析。结果 白木香种子对铜离子还原力、对ABTS+·和DPPH·的清除能力的IC50分别为0.097 75、0.1366、0.4224 mg/mL。在考察范围内，白木香种子的抗氧化能力随着其浓度的增加而增强，但弱于VC。结论 白木香种子有较好的抗氧化能力，为中药制剂的开发及保健品的开发提供一定的参考依据，其药理价值值得进一步深入研究。

白木香种子；铜离子还原；ABTS+·；DPPH·

［Abstract］Objective To explore the antioxidant capacity of Aquilariae sinensis seeds.Methods Aquilariae sinensis seeds were under pretreatment and their flavonoids were extracted.Ascorbic acid（VC）was set as a positive control.The reduction ability was determined by copper ion reduction method.The antioxidant activity of was studied by using 2，2'-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）（ABTS）and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）.Relative total reduction percentage or clearance was measured and calculated.Relative total reduction percentage or clearance as ordinated and the concentration of liquid samples as abscissa，they were obtained by regression and the estimated concentration，whose probability was 0.50 in confidence limit of regression curve was half maximal inhibitory concentration （IC50）.All the data was modeled and analyzed by statistical software SPSS 19.0.Results Aquilariae sinensis seeds of copper ion reduction force IC50was 0.097 75 mg/mL.The IC50of the ability to clear the ABTS+·and DPPH·were 0.1366 mg/mL and 0.4224 mg/mL.Within the scope of the investigation，antioxidant capacity of Aquilariae Sinensis Seeds increased with its concentration，but weaker than VC.Conclusion The Aquilaria Sinensis seeds have good antioxidant capacity and provide a reference for the development of traditional Chinese medicine and health care products，and its pharmacological value is worthy of further study.

［Key words］Aquilaria Sinensis Seeds；Copper ion reduction；ABTS；DPPH·

沉香为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis （Lour.）Gilg含树脂的木材，其味辛、苦，性微温，具行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效，用于治疗胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急［1］。目前白木香种栽培规模不断扩大，在海南、广东等地均有大量种植，仅在广东的种植面积已近20万亩，其中广东电白县已建成万亩产业化生产基地［2-4］。白木香种子是白木香的副产物，目前白木香种子只有少部分用于育苗，其资源未得到有效开发利用［2］。人体的许多疾病和组织损伤等都与体内的氧化应激反应有关，因此，应用抗氧化物质来保持人体健康预防疾病的研究得到越来越多科学家的关注［5-8］。随着科技和工业的发展，抗氧化剂已广泛应用于各个领域，为了减轻自由基的危害，目前寻找高效、低毒或无毒、天然的抗氧化剂，筛选具有抗自由基损伤的物质，具有重要的意义［9］。随着沉香的资源的综合开发利用不断深入，有学者发现沉香叶、沉香茶、沉香种子等非药用部位均有一定的抗氧化的作用［10-12］，而目前对于白木香种子的体外抗氧化研究仅限于DPPH法［13-14］，这种局限性导致不能科学正确、全面充分反映白木香种子的抗氧化能力。本研究将采用铜离子还原能力的测定、ABTS+·清除能力的测定和自由基DPPH·清除能力的测定等三种方法评价白木香种子的体外抗氧化能力，不仅具有一定的国内科研创新性，而且还能为白木香种子的体内抗氧化能力和其他药理作用的研究提供一定的客观依据，有助于白木香的综合开发利用。现将研究结果报道如下:

1　材料与方法

1.1一般材料

白木香种子由广东鹏华科技有限公司提供，经广东省中医院药学部中药师龚又明鉴定为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg的种子；ABTS，化学名称2，2'-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐:厂家Aladdin Lindustrial Corporation，批号（CAS:30931-67-0），纯度98%；DPPH，化学名称1，1-二苯基-2-三硝基苯肼:天津市福晨化学试剂厂，批号（CAS:1898-66-4），纯度96%；新亚铜:天津市福晨化学试剂厂，批号（CAS:34302-69-7），纯度98%；抗坏血酸（Vitamin C，VC）:天津市百世化工有限公司；过硫酸钾（K2S2O8）:天津市大茂化学试剂厂；硫酸铜（Cu-SO4）:成都市科龙化工试剂厂；醋酸铵（CH3COONH4）:天津市大茂化学试剂厂；无水乙醇:天津市富宇精细化工有限公司；实验用水均为去离子水。CP225D十万分之一分析天平:广州市正一科技有限公司；KQ3200DE超声仪（频率:250 Hz）:昆山市超声仪器有限公司；可见-紫外分光光度计（型号:TU-1810PC）:北京普析通用仪器有限公司；SD-250型涡轮式粉碎机:浙江省特种粉碎设备厂，250 mL索氏提取器:郑州兴华玻璃仪器厂。

1.2方法

1.2.1白木香种子的预处理及其黄酮的提取选取适量饱满成熟的白木香种子，置恒温干燥箱中（60.0± 0.2）℃烘12 h，然后研磨过60目。准确称取一定质量的白木香种子干粉用索氏抽提法（石油醚为抽提液，75℃）脱脂及除脂溶性色素，当石油醚抽提液为无色时挥尽石油醚，然后继续用乙酸乙酯，甲醇重复上述过程，最后用60%（体积分数）乙醇浸提，回流提取白木香种子的黄酮［17］。浸提料液比为1∶5（g∶mL），每次浸提2 h，浸提温度为100℃，直到乙醇提取液基本无色，共浸提5次，合并所有的浸提液并进行减压浓缩至恒重，得到浸膏。

1.2.2样品溶液的配制精密称取浸膏10 mg，用无水乙醇定容至10 mL得到浓度1 mg/mL的白木香种子样品液。

1.2.3铜离子还原能力的测定分别取0.5 mL不同浓度的样品液，加入0.01 mol/L CuSO4和7.5 mmol/L新亚铜试剂各0.125 mL混合，再加入0.2 mol/L pH值7.0的NH4Ac缓冲液至总体积为1.0 mL，摇匀，静置30 min，于450 nm波长下测定吸光度值。以溶剂为空白对照，逐一测得吸光度。以VC为阳性对照，平行3次试验。其计算公式如下:相对总还原百分率=（A-A0）/ （Amax-A0）。式中:A0为样品浓度为0时的Amax值；Amax为在一次测量内最大的吸光度值；A为样品的A450 nm值。

1.2.4ABTS+·清除能力的测定 将7 mmol/L ABTS+·溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾水溶液混合，在避光、室温条件下静置12～16 h，形成ABTS自由基储备液。将此储备液与无水乙醇按照约1∶45（V/V）的比例混合，在734 nm下调吸光度为（0.70±0.02），得到ABTS+·工作液，于30℃下预热备用。分别取不同浓度的样品液与ABTS+·工作液混合，摇匀，室温下避光30 min，后在734 nm测定其吸光度，以VC为阳性对照，平行3次试验。其计算公式为:清除率=（A0-A）/A0×100%。式中:A0是未加样品所得的吸光度，A是添加样品后所得的吸光度。

1.2.5DPPH·清除能力的测定精密称取20 mg DPPH，用无水乙醇超声溶解并定容至250 mL容量瓶中，得浓度为0.2 mmol/L的DPPH·溶液（测定吸光度在0.8左右）。分别取不同浓度的样品液与DPPH溶液加入同一具塞试管中，摇匀，避光反应30 min后，用无水乙醇做参比，测定515 nm处溶液的吸光度，以VC为阳性对照，平行3次试验。根据公式计算清除率:清除率（%）=（1-Ai/A0）×100%。式中:Ai是油样与DPPH·溶液混合后的吸光度；A0是对照溶液的吸光度。

1.3观察指标及评价标准

本研究以IC50即氧化剂被抑制一半时抑制剂（还原剂）的浓度为观察指标。按“1.2”项下方法计算结果，以相对总还原百分率或清除率为纵坐标、样品液的浓度为横坐标作线性回归，从回归曲线的置信限制中找到概率为0.50的估算浓度即为IC50。一般认为某种物质的IC50值低于10 mg/mL，该物质具有抗氧化能力［15］。

1.4统计学方法

本研究所得实验数据全部采用Microsoft Office 2010和统计学软件SPSS 19.0进行分析统计及线性回归。从可见-紫外分光光度计下读出不同样品浓度的吸光度（A值），取连续测量三次的平均值，分别通过“1.2”项下的计算公式换算成相对总还原率和清除率，最后以相对总还原百分率或清除率为纵坐标、样品液的浓度为横坐标作线性回归，从回归曲线的置信限制中读出概率为0.50的估算浓度即为IC50。其中，浓度和A值保留2位有效数字，IC50保留4位有效数字。

2　结果

2.1铜离子还原能力的测定结果

在0.02～0.12mg/mL的范围内，白木香种子和VC对铜离子的还原能力呈现线性关系，拟合回归线得到其IC50分别为0.09775、0.01700 mg/mL。见图1。

图1　白木香种子和VC的铜离子还原能力

2.2对ABTS+·的清除作用测定结果

在0.2～1.0 mg/mL的范围内，随着浓度的增加，白木香精油、白木香种子和VC对ABTS+·的清除能力逐渐增强，通过计算得出，其 IC50分别为 0.1366、0.006 179 μg/mL。结果见图2。

图2　白木香种子和VC对2，2'-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基清除能力

2.3对DPPH·的清除作用测定结果

在1.5～25.0 mg/mL的范围内，白木香种子对DPPH·有一定的清除能力，且随着浓度的增加而逐渐增强，并且白木香种子在质量浓度达到一定值时，清除率开始趋于平衡。白木香种子和VC的IC50分别为0.4224、0.005516 mg/mL。结果见图3。

图3　白木香种子和VC对DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基的清除能力

3　讨论

根据结果可以得出，在考查范围内，白木香种子抗氧化能力可以随着其浓度的增加而增强。白木香种子对铜离子还原力、对ABTS+·和DPPH·的清除能力的IC50分别为0.097 75、0.1366、0.4224 mg/mL；而VC对铜离子还原力、对ABTS+·和DPPH·的清除能力的IC50分别为0.017、0.006 179、0.005 516 mg/mL。与VC相比，白木香种子的抗氧化能力明显较弱，但是国内专家一致认为某种物质的IC50值低于10 mg/mL，该物质则具备抗氧化能力［15］。其中，在ABTS+·的清除作用的研究中，白木香种子在浓度为0.3 mg/mL时，清除率可达96%，自由基基本上被完全清除。可以初步得出，白木香种子有较好的抗氧化能力。

目前，段宙位等［16］提取白木香叶中的黄酮类化合物进行体外抗氧化研究，证实白木香叶黄酮提取物具有较强的清除DPPH·和ABTS+·能力。而有研究发现白木香种子含有的5-羟基-7，3'，4'-三甲氧基黄酮、5，3'-二羟基-7，4'-二甲氧基黄酮、5，4'-二羟基-7，3'-二甲氧基黄酮与白木香叶子的黄铜类成分相同，但是，具体是哪种化学成分致使白木香种子有较好的抗氧化能力，以及具体抗氧化机制还有待进一步深入研究。

自由基是人体进行生命活动时所产生的一种活性分子，自由基过多就会导致细胞和组织器官损伤，诱发各种疾病，加速机体衰老。抗氧化剂的抗氧化作用可以通过抑制自由基的产生，或直接清除自由基，甚至可以通过提高内源性抗氧化物质的水平来实现［17］。白木香是我国沉香药材的主要来源，目前沉香市场需求持续扩大，寻求沉香代替产品刻不容缓，其中，白木香种子便宜易得，产量高，却未能得到有效应用。本研究通过铜离子还原法、ABTS法和DPPH法对白木香种子进行体外抗氧化能力测定，结果显示白木香种子对铜离子的还原能力、对ABTS+·和DPPH·的清除能力比VC弱，但是在考察范围内，白木香种子的抗氧化能力随着浓度的增加而增强，并且其IC50均小于10 mg/mL［18］，因此白木香种子有较好的抗氧化能力，这对白木香精油和种子进行体内抗氧化研究提供了一定的参考。

ABTS法是快速简便普遍用于常规抗氧化剂清除自由基能力的评价方法，可测量水溶性化合物也可测量脂溶性化合物，需要自由基的发生体系。DPPH法则不需有自由基的发生体系，有选择性，但局限性是只溶于有机溶剂。以上两种方法测定的都只是非生理条件下的自由基，因此还与铜离子还原法联用，此法测定环境接近生理环境。生物体系中多个抗氧化体系中决定了不能以单一的方法去判断某种物质的抗氧化能力，另外，现采用的抗氧化方法大都是体外抗氧化测定，对于真实的生理环境只能尽可能接近，却无法真正模拟，所以一般抗氧化研究都会选取两种以上的方法来共同说明某物质的抗氧化能力。

随着现代研究逐渐深入，人们越来越意识到沉香药材产业具有巨大的药用开发潜力，在加强药材种植的同时，国内学者扩大了对白木香叶、种子以及花和果实等非药用部位的研究。而在木香非药用部位的资源综合开发利用研究方面，其发明专利主要集中在沉香叶的研究开发，而本研究发现，白木香种子具有较强的抗氧化作用，可为中药制剂的开发及保健品的开发提供一定的参考依据，同时文献研究表明，白木香种子含有多种挥发油成分和营养成分［19-21］。因此有必要对其药理作用进一步进行研究，并筛选药理活性，为其资源的利用开发提供更多的实验依据。

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Study on antioxidant capacity of aquilaria sinensis seeds by three antioxidant methods in vitro

ZHOU Hailing1MA Lin1YI Zhibiao2
1.Department of Pharmacy，Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong Province，Guangzhou510120，China；2.Mathematical Engineering Academy of Chinese Medicine，Guangdong Province，Dongguan523808，China

R917

A

1673-7210（2016）08（a）-0012-04

2016-04-28本文编辑:赵鲁枫）

广东省科技计划项目（2012B01100050，2013B 090800052）；广东省中医药局课题（20142074）。

易智彪（1979-），男，博士；研究方向:系统生物学及中药质控与研发。