地黄饮子脑脊液药物化学研究

郭司群（呼伦贝尔市食品药品检验所　呼伦贝尔　021008）

地黄饮子脑脊液药物化学研究

郭司群（呼伦贝尔市食品药品检验所呼伦贝尔021008）

目的：阐明经方地黄饮子在脑脊液中的化学成分分布情况。方法：利用UPLC-ESI-MS和GC-MS技术分析地黄饮子的体外样品及灌胃给予地黄饮子复方或单味药后的家兔脑脊液样品，对比分析各样品结果，确认灌胃给予地黄饮子后的家兔脑脊液中移行成分、代谢产物及其生药来源。结果：灌胃给予地黄饮子后家兔脑脊液中发现5个移行成分，其中1个为地黄饮子所含的原型成分，4个为新产生的代谢产物。结论：对地黄饮子的脑脊液中移行成分及代谢产物进行了确认，对其进行深入研究，有助于阐明地黄饮子治疗中枢退行性病变的有效成分及作用机理。

地黄饮子 脑脊液 UPLC-MS GC-MS

中药脑脊液药物化学是中药血清药物化学的一个延伸，以血清药物化学技术和方法为基础，综合应用多种现代技术，分析鉴定给药后脑脊液中的移行成分，最终达到阐明治疗中枢性病变中药药效物质基础的目的。地黄饮子出自《黄帝素问宣明论方》，主治瘖痱证，症见舌强不能言，足废不能用，口干不欲饮，苔黄腻，脉沉、细弱［1］。临床研究表明，地黄饮子对中枢神经系统原发性退行性变性疾病——老年性痴呆的疗效确切［2］，但基础研究薄弱。为了阐明地黄饮子到底是以何种成分、何种形式发挥治疗作用以及作用机理如何，本文作了以下研究。

1　实验部分

1.1仪器与试剂：UPLC-MS联用系统：WatersAC-QUITY UPLC超高效液相色谱仪，Waters Quattro PremierxE三重四级杆串联质谱仪，MassLynx 4.1质谱工作站；美国安捷伦公司6890N-5975B气质联用仪；AMDIS软件、Chemstation及NIST 05a质谱库（美国安捷伦公司）Shim-pack xR-ODSⅡ2.0mm*75mm色谱柱（SHIMADZU）；TGL-16G-C高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；H66MC型超声震荡仪（昆山市超声仪器有限公司）；SK-1型快速混匀器（金坛市医疗仪器厂）；地黄饮子组方药材熟地黄、山茱萸、五味子、巴戟天、麦冬、薄荷、石菖蒲、石斛、远志、附子、肉苁蓉、茯苓、肉桂、大枣、姜（购于哈尔滨三棵树药材市场，经黑龙江中医药大学教授谢宁鉴定为正品）；五味子醇甲（Schizandrol A，中国生物制品药品检定所，批号：110857-200709）；乙腈、甲醇、甲酸（色谱纯，美国迪马公司）；甲酸胺（分析纯，天津科密欧试剂有限公司）；正己烷（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；吡啶（分析级，天津光复科技发展有限公司）；Chlorotrimethylsilane TMCS（98%Acros Organics USA）；MSTFA（Apollo Scientificl Limited UK）；新西兰白兔，体重1.8～2.2kg，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证编号：SCxK（黑）2007003。

1.2实验过程

1.2.1样品制备

1.2.1.1地黄饮子复方及单味药材体外样品制备：取地黄饮子粉末1g（各药材粉末66mg，混匀）或单味药材粉末66mg，分别置于25mL容量瓶中，加甲醇20mL左右，浸泡20min，超声30min，放冷，再加甲醇定容，取上清液3000r/min离心15min，过0.45μm滤膜，取续滤液作为UPLC-ESI-MS分析样品溶液。取地黄饮子粉末1g（各药材粉末66mg，混匀）或单味药材粉末66mg，分别置10mL容量瓶中，加入正己烷8mL左右，浸泡20min，超声处理30min，放冷，再加正己烷定容，取上清液3000r/min离心15min，过0.45μm滤膜，取续滤液作为GC-MS分析样品溶液。

1.2.1.2脑脊液样品制备

①脑脊液采集：取家兔，灌胃前禁食12h，自由饮水，连续灌胃3d（空白组灌胃给予蒸馏水，其他组灌胃给予相应药液），1次/d，50mL/次，末次灌胃120min后取家兔脑脊液，离心10min （4℃，3000r/min），取上清液备用。

②脑脊液样品制备：取脑脊液1mL，加入5mL甲醇，涡旋3min，超声10min，离心10min（4℃，3000r/min），取出上清液，35℃下氮气吹干，残渣用1mL甲醇复溶，超声1min，涡旋震荡30s后，离心10min（4℃，10000r/min），取上层清液供UPLC-ESI-MS分析。

取脑脊液100μL，加入500μL甲醇，涡旋3min，超声10min，离心10min（4℃，10000r/min），取出上清液，35℃下氮气吹干，加15mg/mL甲氧胺吡啶溶液100μL，混匀，70℃下反应1h。加衍生化试剂（MSTFA：TMCS=100∶1，v/v）100μL，密封，70℃下反应1h，加正己烷200μL，混匀后离心10min（4℃，5000r/ min），取上层清液供GC-MS分析。

1.2.2分析条件

1.2.2.1UPLC-ESI-MS分析条件：色谱柱：Acquity UPLC BEH C181.7μm，2.1mm×50mm；流动相：A：乙腈，B：0.1%甲酸+10mmol/L甲酸胺；梯度洗脱程序为乙腈的浓度梯度5.0%（0min），5.0%～50%（0～10min），50%～80%（10～15min），80%～95%（15～17min）；柱温：30℃；流量：0.3mL/min；电喷雾接正离子模式；毛细管电压：3.00kV；锥孔电压：35.00V；离子源温度：110℃；脱溶剂温度：350℃；脱溶剂气N2：600L/h；锥孔气N2：50L/h。

1.2.2.2GC-MS分析条件：色谱柱：5HP-MS；载气：氦气；流速：1mL/min；进样口温度：240℃；分流进样，分流比1∶20；辅助线温度：280℃；进样量：1μL；梯度升温程序为80℃（0min），120℃（0～20min），180℃（20～32min），197℃（32～40.5min），280℃（40.5～54.3min）；后运行温度280℃；后运行时间10min；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；电离方式：EI；采集方式：全扫描；扫描质量范围：30～600mAu；溶剂延迟时间：4min。

2　结果与讨论

2.1地黄饮子脑脊液中移行成分认定：比较地黄饮子复方脑脊液样品和空白脑脊液样品的UPLC-MS分析提取离子色谱图，分析各色谱峰保留时间和分子离子峰数据，发现地黄饮子复方脑脊液样品中出现4个移行成分，即保留时间为5.58min、分子量为417的成分1；保留时间为7.33min、分子量为431的成分2；保留时间为8.85min、分子量为415的成分3；保留时间为9.27min、分子量为401的成分4；在空白脑脊液样品中没有发现这4种成分（见图-1）。比较地黄饮子复方脑脊液样品和空白脑脊液样品的GC-MS的总离子流图，分析各色谱峰保留时间和质谱数据，发现地黄饮子复方脑脊液样品中出现1个移行成分，即保留时间为34.25min、分子量为452的成分5（见图-2）。

2.2地黄饮子脑脊液中移行成分来源归属：比对分析地黄饮子复方、单味药材体外样品和脑脊液样品，确认了地黄饮子脑脊液中移行成分的生药来源归属。

以3号和5号成分为例，经复方脑脊液样品、五味子脑脊液样品、五味子体外样品和五味子醇甲对照品比对分析，发现3号成分来源于五味子，而且与五味子醇甲的保留时间、分子量相同，确定其为来源于五味子的五味子醇甲（见图-3、图-4）。

5号成分经复方脑脊液样品和远志脑脊液样品进行GCMS衍生化技术分析比对，发现复方脑脊液样品中5号成分与远志脑脊液样品相同保留时间处成分，分子量相同，确定来源于远志药材（见图-5、图-6）。

2.3讨论：本研究初步进行了地黄饮子的脑脊液药物化学研究，共找到5个脑脊液中移行成分，其中1个为地黄饮子所含的原型成分（即来源于五味子的五味子醇甲），4个为新产生的代谢产物，分别由五味子、远志、麦冬、巴戟天贡献产生。分析发现五味子为地黄饮子入脑成分的主要来源药材。地黄饮子具有滋肾阴、补肾阳、开窍化痰的功效，多用于脑血栓、脑血管意外、中风、泛发性神经皮炎、老年病等多种脑部疾病的治疗，目前研究表明它对老年性痴呆有良好的疗效［2］。脑部病变是指因中枢神经纤维损伤进而造成脑神经细胞衰老退化造成的慢性退行性疾病，包括脑实质的软化灶（脑梗塞，陈旧性的出血）、双侧脑白质稀疏、脑萎缩以及以老年斑、神经元纤维缠结为主要病理特征的进行性中枢神经系统退行性变性疾病（老年性痴呆）［3］。五味子具有敛肺、滋肾、生津、收汗、涩精等功效，对中枢神经系统有着重要的作用，包括抗衰老、益智、镇静、催眠，其中五味子醇甲具有神经保护作用［4］。其他三味药材远志、麦冬、巴戟天对中枢神经系统病变有着一定的治疗作用。远志有安神益智、祛痰、消肿的功效，对神经系统作用包括镇静、抗惊厥，促进体力和智力，抗痴呆和脑保护活性等［5］。麦冬具有养阴生津、润肺清心的功效，有研究表明麦冬煎剂有镇静作用，亦能加强氯丙嗪的镇静作用，增强戊巴比妥钠的催眠作用，拮抗咖啡因的兴奋作用等［6］。巴戟天则有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效，与地黄饮子滋肾阴、补肾阳功效吻合。

本实验首次利用UPLC-ESI-MS和GC-MS两种技术对地黄饮子脑脊液药物化学进行研究。UPLC-MS技术能够提供较为丰富且全面的信息，被广泛应用于中药体内代谢研究。本实验首次将GC-MS衍生化技术应用于脑脊液药物化学研究，通过实验结果可以看出，我们利用GC-MS衍生化技术对地黄饮子脑脊液进行分析，成功找到了1个脑脊液中移行成分，为UPLC-MS的分析结果提供了重要的补充，使地黄饮子脑脊液药物化学的研究结果更加全面。

［1］张福珍，张春珍，李幽馥.地黄饮子在防治老年病中的地位与应用［J］.中医药学报，1994，23（2）：28-29.

［2］谢宁，柳琳，周妍妍，等.地黄饮子对老年性痴呆模型大鼠脑组织NO、NOS含量及行为学的影响［J］.中国中医药科技，2004，11 （2）：84-85.

［3］卓敏.疼痛的神经生物学——理解大脑机制及神经疾病治疗的机理［J］.世界科技研究与发展，2000，11（7）：665-666.

［4］赵洪海，王晓蕾，张可兴，等.五味子的现代药理作用研究进展［J］.中医药信息，2010，27（4）：123-125.

［5］屠鹏飞，姜勇.中药创新药物的发现与研发［J］.中国天然药物，2007，2：81-86.

［6］陈屏，徐东铭，雷军.麦冬化学成分及药理作用的研究现状［J］.长春中医学院学报，2004，20（1）：35.

Identification and Analysis of Constituents Absorbed into Cerebrospinal Fluid after Oral Administration of Di Huang Yin Zi

Guo Siqun（Hulunbeier Institute for Food and Drug Control，Inner Mongolia，Hulunbeier 021008，China）

Objective:To identification and analyze the constituents absorbed into cerebrospinal fluid of Di Huang Yin Zi.Method:Two valid methods using Ultra Performance Liquid Chromatography coupled with electrospray ionization（ESI）Mass spectrometry and Gas chromatography-Mass spectrometry were established for the study of the absorbed components in rabbit cerebrospinal fluid after oral administration of Di Huang Yin Zi.Result:Five compounds including one original form compound and four metabolites were observed from a comprehensive analysis of the chromatography of Di Huang Yin Zi，controlled cerebrospinal fluid and dosed cerebrospinal fluid. Conclusion:This study developed a method for screening the bioactive constituents in cerebrospinal fluid after oral administration of Chinese herbal medicine and provided helpful chemical information for further pharmacology and active mechanism research on TCM.

Di Huang Yin Zi Cerebrospinal fluid UPLC-MS GC-MS

R285

B

1672-8351（2016）02-0132-03