YAP在人甲状腺乳头状癌中的表达及对细胞生长的影响

章　杰，林　义，林　雅

(浙江省温岭市第一人民医院病理科　317500)



YAP在人甲状腺乳头状癌中的表达及对细胞生长的影响

章杰，林义，林雅

(浙江省温岭市第一人民医院病理科317500)

目的探讨Yes相关蛋白(YAP)在人甲状腺乳头状癌中的表达及对甲状腺乳头状癌细胞生长的影响。方法收集57例该院普通外科行手术切除的甲状腺乳头状癌及对应癌旁组织标本，所有患者均经病理诊断确认，免疫组织化学染色检测甲状腺乳头状癌及癌旁组织中的YAP表达，统计分析YAP蛋白与肿瘤临床病理资料间的相关性。siRNA沉默甲状腺乳头状癌B-CPAP细胞中YAP基因表达，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)及流式细胞技术检测沉默YAP后B-CPAP细胞增殖及凋亡水平变化。结果YAP蛋白在甲状腺乳头状癌组织中表达水平显著高于对应癌旁组织(P<0.05)；且YAP蛋白表达与TNM分期和肿瘤体积呈显著正相关(P<0.05)，沉默YAP基因可显著降低B-CPAP细胞的增殖能力，并促使细胞发生凋亡(P<0.05)。结论YAP在甲状腺乳头状癌组织中高表达并与肿瘤不良临床病理特征有关，下调YAP基因可显著抑制甲状腺乳头状癌细胞生长。

Yes相关蛋白；癌,乳头状;甲状腺肿瘤；基因表达；细胞增殖

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一，其中甲状腺乳头状癌是其主要病理类型[1]，甲状腺癌早期症状隐匿、诊断困难、易发生转移，极大地危害广大人民群众的身体健康[2]。近年来大规模的流行病学研究显示[3]，约半数以上的患者在确诊一年内死亡，而仅有5%的患者生存期超过5年。因此，对于甲状腺癌发生发展的分子生物学研究，对改善我国未来甲状腺癌的诊治水平具有重要意义。

Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)定位于人类染色体11q13.1上[4]，作为一个转录调控因子，在细胞内能够调节包括SMAD(mothers against decapentaplegic protein)家族成员[5]和转录增强区域(transcriptional enhancer domain，TEAD)转录因子家族成员[6]等多个转录因子的活性。近年研究发现，YAP对细胞增殖具有异常的促进作用，因而将YAP定义为一种重要的促癌基因，其生物学效应亦在许多人类恶性肿瘤中得到验证[7]。目前，YAP在甲状腺乳头状癌中的表达及对癌症细胞生长的调节作用尚不完全清楚。本研究通过免疫组织化学、基因转染及增殖凋亡检测等方法研究了YAP在甲状腺乳头状癌组织中的表达情况及沉默YAP对甲状腺乳头状瘤B-CPAP细胞增殖、凋亡的影响，旨在明确YAP基因在甲状腺乳头状癌诊断及治疗分子中的潜在临床及生物学意义。

1　资料与方法

1.1一般资料收集57例于2011年5月至2014年2月间在本院普通外科行手术切除的甲状腺癌患者，所有患者均经病理证实为甲状腺乳头状癌的组织及对应癌旁组织标本。入组患者年龄40～71岁，平均(54.5±15.5)岁，其中男37例，女20例。标本于离体30 min内取材并于中性福尔马林溶液中保存。

1.2主要试剂兔SP免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物科技有限公司。Trizol试剂及脂质体2000(LipofectamineTM 2000)购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒及real time PCR试剂盒购自大连宝生生物工程有限公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国Roche公司；YAP引物，正向5′-CCT GCG TAG CCA GTT ACC AA-3′；反向5′-CCA TCT CAT CCA CAC TGT TC-3′，β-actin引物，正向5′-CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT-3′；反向5′-GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3′，由上海生工生物科技有限公司合成；YAP特异性siRNA(sc-38637)及兔抗人YAP多克隆抗体(sc-17140)均购自美国Santa Cruz公司。

1.3免疫组织化学石蜡组织切片经脱蜡、水化后，按SP免疫组织化学试剂盒说明书要求进行免疫组织化学染色。兔抗人YAP一抗工作浓度为1∶100，二抗采用生物素标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体，DAB显色、苏木素复染，常规脱水、透明、中性树胶封片。高倍镜(×400)下随机选取10个组织视野，按文献所述方法[8]进行阅片、评分，取10个视野的平均得分作为切片的最终评分。

1.4细胞培养甲状腺乳头状癌细胞B-CPAP由本实验室保存。采用含10%胎牛血清的DMEM培养基在适宜条件下进行培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.5细胞转染B-CPAP细胞接种于6孔板中，参照LipofectamineTM 2000转染试剂说明书分别向B-CPAP细胞中转染入阴性对照siRNA(阴性对照组)和YAP特异性siRNA(YAP siRNA组)，转染结束后采用qRT-PCR法检测YAP mRNA表达以确证转染效果。

1.6qRT-PCR按RNA提取试剂说明书方法提取细胞中的总RNA，按逆转录及PCR扩增试剂盒说明书进行反应。以β-actin基因为内参，采用2-△△ct法计算YAP mRNA相对表达量。

1.7MTT检测分别收集转染0、24、48、72 h后的B-CPAP细胞，接种于96孔板内进行MTT检测，于酶标仪上490 nm测定各孔的吸光度(A)值。

1.8流式细胞技术检测取转染72 h后的B-CPAP细胞，按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明，通过流式细胞仪进行细胞凋亡检测。

2　结　　果

2.1甲状腺乳头状癌及对应癌旁组织中YAP 蛋白的表达情况通过免疫组织化学方法检测57例甲状腺乳头状癌及对应癌旁组织中YAP的表达情况。甲状腺乳头状癌组织中YAP阳性表达率为75.44%(43/57)，而癌旁组织中YAP阳性表达率仅为33.33%(19/57)，两者间表达差异有统计学意义(χ2=20.367，P<0.01)。见图1。

图1　YAP蛋白在甲状腺乳头状癌及对应癌旁组织中的表达(免疫组织化学×400)

2.2YAP表达与甲状腺乳头状癌临床病理特征间的相关性分析癌组织中YAP蛋白的表达与甲状腺乳头状癌肿瘤体积及TNM分期呈正相关(P<0.05)，提示肿瘤中YAP蛋白阳性表达的患者可能预后不良。见表1。

表1　　YAP 表达与甲状腺乳头状癌患者临床病理 特征的关系[n]

χ2、P为各项目中不同分组YAP阳性率比较所得。

2.3siRNA下调甲状腺乳头状癌B-CPAP细胞中YAP的表达在B-CPAP细胞中瞬时转染入YAP特异性siRNA及阴性对照siRNA，qRT-PCR法检测得，与阴性对照组比较，YAP siRNA组B-CPAP细胞中YAP mRNA的表达水平显著下调(P<0.05)，见图2。

*：P<0.05，与阴性对照组比较。

图2siRNA下调B-CPAP细胞中YAP的表达水平

2.4下调YAP的表达能抑制B-CPAP细胞的增殖并促进其凋亡于转染0、24、48、72 h后，采用MTT检测细胞增殖能力的变化；结果显示，与阴性对照组比较，YAP siRNA组B-CPAP细胞增殖能力降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3A。为进一步验证沉默YAP对细胞增殖的影响，作者使用siRNA转染B-CPAP细胞72 h后，采用流式细胞技术检测细胞凋亡变化；与阴性对照组比较，YAP siRNA组可明显增加B-CPAP细胞的细胞比例(P<0.05)见图3B、C。

A：增殖曲线图；B ：阴性对照siRNA、YAP siRNA细胞凋亡图；C：凋亡分析图。

图3沉默YAP对B-CPAP细胞增殖、凋亡的影响

3　讨　　论

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤之一。目前，甲状腺癌治疗的主要方法是根治性手术及术后规范放、化疗[9]，但甲状腺癌早期症状不明显，诊断困难，且易发生淋巴转移，因此多数患者就诊时已失去根治性手术机会，对放化疗敏感程度的个体差异性也是导致术后早期复发、转移的主要原因。近年来，利妥昔单抗[10]及贝伐单抗[11]等分子靶向治疗药物在甲状腺癌的治疗中显现出一定优势，有关甲状腺癌的分子生物学诊断和生物靶向治疗的研究能给甲状腺癌的早期诊治提供参考依据，具有重要的意义。

近年来，许多学者都进行了YAP与肿瘤的相关性研究。在乳腺癌[12]中，YAP在mRNA及蛋白水平均呈现异常高表达，并与患者不良预后显著相关。除此之外，YAP基因和经典癌基因KRAS一同促进细胞发生上皮细胞间质化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)改变，从而增加肿瘤的恶性生物学表型[13]。Tu等[14]研究发现，肝癌组织中YAP基因表达与肿瘤恶性临床表型及术后较短的生存期呈正相关，利用siRNA在沉默肝癌细胞中YAP的表达可显著抑制肝癌细胞的增殖能力并促进其凋亡。

本研究证实，YAP在甲状腺乳头状癌中呈明显高表达趋势，且与甲状腺乳头状癌的肿瘤体积增大及高TNM分期显著相关，提示YAP可能在甲状腺乳头状癌生长、转移过程中发挥重要作用。为进一步探究YAP是否能对甲状腺乳头状癌细胞生长产生调节效应，作者通过特异性siRNA沉默了B-CPAP细胞中YAP基因的表达，通过MTT及流式细胞术检测发现，下调YAP基因的表达水平不仅能阻碍B-CPAP细胞的增殖能力而且可以促进细胞凋亡的发生，这一效应可能与沉默YAP后，其所调控的下游包括survivin、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)和cyclin D1在内[15]的多种促生长转录因子形成减少有关。

综上所述，YAP在甲状腺乳头状癌中呈现异常的高表达趋势，而且其异常高表达与甲状腺乳头状癌不良临床及病理特征相关。YAP有可能是甲状腺乳头状癌发生发展过程中的重要调节因子。

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Expression of YAP in human papillary thyroid cancer and its influence on cell growth

ZhangJie,LinYi,LinYa

(DepartmentofPathology,FirstPeople′sHospitalofWenlingcity,Wenling,Zhejiang317500,China)

ObjectiveTo investigate the expression of Yes-associated protein(YAP) in human papillary thyroid cancer and its influence on cell growth.MethodsThe samples in 57 cases of papillary thyroid cancer treated by operation resection in the general surgery department of this hospital and the matched tumor-adjacent tissues were collected.All the cases were definitely diagnosed by the pathology examination.The expression of YAP protein in the cancer tissue and corresponding tumor-adjacent tissue were determined by the immunohistochemistry(IHC)staining.The relationship between the YAP protein and the clinicopathological data was statistically analyzed.siRNA was used to silence the expression of YAP in B-CPAP cells,MTT and flow cytometry were used to measure the proliferation and apoptosis changes.ResultsThe expression level of YAP was markedly higher in papillary thyroid cancer tissues than in tumor adjacent tissues (P<0.05);moreover the expression of YAP protein was positively correlated with the tumor size and TNM stage (P<0.05).Silencing YAP gene could significantly inhibit the cell proliferation ability and promote cell apoptosis(P<0.05).ConclusionYAP is highly expressed in papillary thyroid cancer tissues and is related with its adverse clinicopathological characteristics,down-regulating YAP gene can significantly inhibit the cell growth.

Yes-associated protein;carcinoma,papillary;thyroid neoplasms;gene expression;cell proliferation

章杰(1982-)，主治医师，本科，主要从事胃肠肿瘤病理诊断工作。

论著·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.022

R736.1

A

1671-8348(2016)12-1653-03

2015-11-30

2015-12-27)