烟草糖基转移酶基因NtGT5b的克隆与序列特征分析

任学良，李立芹，许 力，郭玉双，鲁黎明

(1.贵州省烟草科学研究院烟草行业分子遗传重点实验室，贵州 贵阳 550081；2.四川农业大学农学院，四川 成都 611130)

烟草糖基转移酶基因NtGT5b的克隆与序列特征分析

任学良1，李立芹2，许 力2，郭玉双1，鲁黎明2

(1.贵州省烟草科学研究院烟草行业分子遗传重点实验室，贵州 贵阳 550081；2.四川农业大学农学院，四川 成都 611130)

为研究烟草糖基转移酶的生物学功能，根据在GenBank上登录的烟草糖基转移酶基因NtGT5b(登录号 BAD93690.1)的CDS序列，设计特异性引物，并以烟草栽培品种K 326总 RNA 逆转录后的cDNA为模板，采用PCR方法，成功获得了烟草糖基转移酶基因NtGT5b的全长CDS序列。生物信息学分析结果表明，该基因CDS全长1 458 bp，所编码的蛋白质包含485个氨基酸。其相对分子质量为54.31 kD，等电点为5.47。在二级结构上，α-螺旋和无规则卷曲为NtGT5b蛋白质的主要结构形式，而β-折叠延伸链与β-转角则相对较少。在三级结构上，该蛋白质主要由α-螺旋与β-折叠构成。NtGT5b蛋白质是一个亲水性蛋白质，含有3个糖基化位点，不含信号肽，包含有糖基转移酶家族的功能保守域PLN02410，属于GTB类型的糖基转移酶超级家族，推测具有糖基转移的功能。

烟草；糖基转移酶；基因

在植物体内，糖基转移酶(Glycosyltransferase，GTs)是一类十分重要的多基因家族酶类[1-2]。糖基转移酶能够催化糖基转移反应，将糖基从活化的供体分子转移到不同受体。由于糖基化反应的受体分子多种多样，如植物次生代谢、外源性物质等；而接受了糖基的受体分子的生物活性大为改变，所以，在植物体内，糖基转移酶广泛参与了植物的信号转导、植物激素平衡以及防御反应等生理生化过程，因而，在植物的生长发育过程中发挥了十分重要的作用[3-5]。近年来，随着对植物糖基化反应研究的深入进行，许多植物的糖基转移酶基因被克隆出来，并得到了较为深入的研究，如XU等[6]克隆出来赤小豆的糖基转移酶基因、DHAUBHADEL等[7]对大豆的糖基转移酶基因进行了克隆。此外，水稻[8]、拟南芥[9]、烟草[10-11]、小麦[12]、水仙[13]等植物的糖基转移酶基因也被克隆出来。同时，植物糖基转移酶基因的功能研究也取得了较大的进展。徐孟亮等[8]的研究表明，OsCrGtl基因主要受低温诱导，推测其可能与水稻的耐冷性关系密切。ACKSON等[9]对拟南芥UGI84B1基因的研究证实，该基因的过表达使转基因植株出现类似 IAA 缺乏的表型，如分枝程度增高、植株矮化以及根的向地性发生改变等。王卓[14]、王雪等[15]及王薇葳等[16]将烟草糖基转移酶基因sm-Ngtl克隆出来，并在烟草及水稻中进行了过表达，结果表明，转基因植株出现株高降低的现象。尽管已经有一些烟草糖基转移酶被克隆出来[10-11]，然而，无论是在克隆的数量上，还是在研究的深度方面，都稍显欠缺。因此，本研究以在NCBI 数据库中登录的烟草NtGT5b基因的CDS序列为研究对象，从普通栽培品种K 326中将其全长克隆出来；同时，利用各种生物信息学分析软件，对其所编码蛋白质的氨基酸特征特性进行了分析，并预测了其二级及三级结构，旨在为烟草糖基转移酶的功能研究提供借鉴。

1 材料与方法

1.1材料

供试材料为烟草普通栽培品种 K 326 (Nicotianatabacumcv. K 326)。

1.2试剂

PCR反应试剂以及各种限制性内切酶等均购自大连宝生物公司，Superscript II反转录试剂盒系Invitrogen公司产品；Trizol购自北京天根生化公司；氨苄青霉素及其他常规试剂均为国产试剂。PCR特异引物合成及PCR产物测序均由上海生工公司完成。

1.3方法

1.3.1 RNA提取与cDNA合成 烟草幼苗的培养以及烟草总RNA的提取，采用鲁黎明等[17]的方法进行。cDNA第1链的合成，根据反转录试剂盒的说明进行。

1.3.2 引物的设计及基因的克隆

1.3.2.1 特异引物的设计 通过在NCBI的Genebank进行检索，获得了NtGT5b的CDS序列(登录号BAD 93690.1)。然后，采用Primer 5.0软件进行特异引物的设计。所设计的引物序列为：正向：NtGT5b-F: 5’-ATGAAAGAAACCAAGAAAATAG-3’ ，反向：NtGT5b-R: 5’-TTATTGAGAATTCTCCATGATA-3’。

1.3.2.2 基因的克隆与测序 目的基因的克隆，采用PCR方法进行。反应体系为(反应总体系为50 μL): 10×Taq Buffer (mg2+)5 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol·L-1) 4 μL，正向引物(10 μmol·L-1)0.5 μL，反向引物 (10 μmol·L-1) 10.5 μL，反转录产物0.5 μL，DNA聚合酶0.5 μL，双蒸水添加至50 μL。扩增反应程序为: 94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火50 s，72 ℃延伸1.5 min，35个循环，最后，72 ℃ 10 min。采用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测后，切胶回收目的片段。然后，进行载体连接，并转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆进行测序。

1.3.3NtGT5b的生物信息学分析 根据全长cDNA序列，利用DNAMAN软件，推测目的基因的氨基酸序列及氨基酸的组成，分析其相对分子质量、等电点及疏水性，并进行蛋白质同源性分析。NtGT5b编码蛋白质的结构保守功能域分析，利用NCBI的蛋白质结构功能域分析软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi) 进行。NtGT5b编码蛋白质的二级结构分析，利用在线软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)进行，同时，在线分析NtGT5b编码蛋白质的三级结构(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)。采用在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽预测，并分析其糖基化位点(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)。目标蛋白质的亚细胞定位分析，利用在线软件PSORT II Prediction (http://psort.hgc.jp/form.html) 进行。

2 结果与分析

2.1烟草NtGT5b的克隆

利用琼脂糖凝胶电泳，对所提取的烟草幼苗总RNA的质量进行了检测。结果表明，总RNA总体质量较高，条带清晰，无拖尾，可以进行下一步的基因克隆(图1-A)。

然后，以烟草总RNA反转录合成的cDNA为模板，采用PCR的方法，进行了目的基因的扩增。电泳检测的结果显示，在1 500 bp附近，有1条较为明亮的条带(图1-B)。将此条带进行回收、纯化、测序，表明该片段全长1 458 bp(图2)。将此序列在NCBI上进行BLAST，结果表明，该片段与在该网站登录的NtGT5b(登录号BAD 93690.1)的序列完全相同。此结果说明，NtGT5b已经成功克隆出来。

2.2烟草NtGT5b编码蛋白质序列的序列特征分析

2.2.1NtGT5b所编码蛋白质的氨基酸序列及理化性质分析 将所克隆出来的基因序列，采用DNA MAN软件，分析了其编码的氨基酸序列以及所编码蛋白质的相对分子质量及等电点。

分析结果表明，该基因编码是由485个氨基酸所组成的蛋白质序列(图2)。该蛋白质的推测相对分子

质量为54.31 kD，理论等电点为5.47。有20种基本氨基酸参与了该蛋白质的组成(表1)，其中，含量最高的为亮氨酸(Leu)，占10.3%；含量最少为酪氨酸(Tyr)，占 2.1%。NtGT5b蛋白质的分子式为C2 443H3 800N632O718S25，组成的原子总数为7 618个。预测该蛋白质不稳定系数为46.29，表明该蛋白质为一个不稳定蛋白质。同时，NtGT5b蛋白质不包含信号肽；但其序列中包含有3个糖基化位点，分别处于第111，114位及383位氨基酸处。

A.烟草总RNA检测图；B.目的基因扩增条带。 A.Tobacco total RNA; B.Target gene cloning.

图2 NtGT5b 基因的cDNA序列及其推测的蛋白质序列Fig.2 cDNA sequence of NtGT5b gene and its deduced protein sequence

2.2.2NtGT5b蛋白质的亚细胞定位与功能结构域分析 利用在线软件PSORT II Prediction对NtGT5b蛋白质进行了亚细胞定位情况分析。结果表明，NtGT5b蛋白质广泛地分布在烟草细胞的细胞器及质膜中。其在微体、质膜、线粒体基质空间及溶酶体分布分别达到了48.1%,45.0%,10.0%及10.0%，其中在微体及细胞膜上的分布较多。

对推测目标蛋白质进行功能保守域分析，对于了解其功能十分重要。因此，利用NCBI 的蛋白质功能保守域分析软件，对NtGT5b蛋白质的氨基酸序列进行了分析，结果表明，NtGT5b的氨基酸序列中包含糖基转移酶家族的功能保守域PLN02410(图3)。该功能保守域是UDP-糖基转移酶的功能结构域，属于GTB类型的糖基转移酶超级家族。由此可以推断，NtGT5b蛋白质隶属于GTB类型的糖基转移酶超级家族，具有糖基转移酶的功能保守域，很可能具有糖基转移的功能。

表1 烟草NtGT5b 蛋白质的氨基酸组成Table 1 Amino acid composition of NtGT5b proteins

糖基转移酶超级GTB家族

2.2.3 NtGT5b蛋白质的疏水性分析 通过分析蛋白质的疏水性，对了解其高级结构有较大的帮助，同时，还对分析与了解其功能具有重要意义。因此，利用DNAMAN软件，对NtGT5b蛋白质进行了疏水性分析。分析结果表明，该蛋白质氨基酸序列中，既包含亲水性氨基酸，也包含有疏水性氨基酸，但以亲水性氨基酸所占的比例较大(图4)。同时，在该蛋白质中，含有负电荷氨基酸(Asp+Glu)61个，正电荷氨基酸(Arg+Lys)47个，其疏水指数为86.82，平均亲水性(GRAVY)为-0.160。一般认为，该分值愈低，则亲水性愈强[18]。由此可以推断，NtGT5b蛋白质是一种亲水、可溶性蛋白质。

2.2.4 NtGT5b蛋白质的二级结构预测 利用在线软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)，对NtGT5b蛋白质进行了二级结构预测，结果如图5所示。该蛋白质中，有147个氨基酸可能参与了α-螺旋，所占比例为30.31%；有97个氨基酸可能参与了β-折叠延伸链， 所占比例为20.00%； 有241个氨基酸可能参与了无规则卷曲，所占比例为49.69%。由此说明，在NtGT5b蛋白质的二级结构中，无规则卷曲和α-螺旋是主要的结构形式，而β-折叠延伸链则所占比例较少。

图4 NtGT5b氨基酸疏水性/亲水性分析Fig.4 Hydrophobicity / hydrophilicity analysis of thededuced amino acid sequence of NtGT5b protein

h, Alpha helix；e, Extended strand；c, Random coil

2.2.5 NtGT5b蛋白质的三级结构预测 利用在线软件 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)的自动建模功能，对NtGT5b蛋白质的三级结构进行了预测，结果如图6所示。NtGT5b蛋白质的三维结构与苜蓿(Medicagotruncatula)的三萜UDP糖基转移酶蛋白质三维结构特点基本相同，属于UDP糖基转移酶类蛋白质，并隶属于UDP-Glycosytransferase/glycogen phosphorylase超级家族。NtGT5b蛋白质包含有44%的α螺旋以及12%的β折叠。此结果说明，NtGT5b蛋白质很可能与苜蓿三萜UDP糖基转移酶的功能相类似。

图6 烟草NtGT5b蛋白质三级结构预测Fig.6 Predicted three-dimensional structure ofNtGT5b protein

Tc. Theobroma cacao (可可); Pt. Populus trichocarpa (杨树);Vv. Vitis vinifera (葡萄); Lb. Lycium barbarum (枸杞);Ws. Withania somnifera (睡茄); Ib. Ipomoea batatas (甘薯);Gs. Glycine soja (野生大豆); Ad. Actinidiadeliciosa (猕猴桃); Arabidopsis thialina (拟南芥)

2.2.6NtGT5b基因的同源性分析 为探明NtGT5b与其他植物的糖基转移酶基因的同源性，在NCBI数据库中进行了 BLASTP。分析发现，NtGT5b所编码的蛋白质与拟南芥(Arabidopsistheliana)的AtGT73B1、枸杞(Lyciumbarbarum)LbGT1、睡茄(Withaniasomnifera)的WsGT1、甘薯(Ipomoeabatatas)的IbGT1、可可(Theobromacacao)的TcGT1、猕猴桃(Actinidiadeliciosa)的AdGT1、杨树的(Populustrichocarpa)PtGT1、葡萄(Vitisvinifera)的VvGT1及野生大豆(Glycinesoja)的GsGT1有一定的序列相似性。其中，与枸杞(Lyciumbarbarum)的序列相似性最高，而与拟南芥AtGT73B1的同源性相对较低。

3 结论与讨论

糖基转移酶可以催化糖基从供体向受体分子的转移，其数量巨大，在原核及真核生物中分布广泛[18]。根据其序列、化学性质、糖苷的连接方式以及受体分子等的不同，糖基转移酶可以分为92个超家族，其中，植物的糖基转移酶家族1(GT1)为最大家族[19-20]。本研究所克隆到的NtGT5b，在氨基酸序列上与拟南芥(Arabidopsistheliana)的AtGT73B1、枸杞(Lyciumbarbarum)LbGT1、睡茄(Withaniasomnifera)的WsGT1、甘薯(Ipomoeabatatas)的IbGT1、可可(Theobromacacao)的TcGT1、猕猴桃(Actinidiadeliciosa)的AdGT1、杨树的(Populustrichocarpa)PtGT1、葡萄(Vitisvinifera)的VvGT1及野生大豆(Glycinesoja)的GsGT1有较高的序列相似性。此结果表明，烟草的NtGT5b可能具有上述这些糖基转移酶的功能。更为重要的是，在NtGT5b蛋白质的序列中，包含有糖基转移酶家族的功能保守域PLN02410。由于该保守域属于GTB类型的糖基转移酶超级家族，所以，烟草的NtGT5b可能隶属于GTB类型的糖基转移酶超级家族，并推测具有糖基转移的功能。

由于糖基转移酶广泛参与了植物的生长发育调节过程，因此，近年来对其研究也逐渐成为热点。如，林凡云等[12]克隆了小麦的2个糖基转移酶基因TaUGT1 与TaUGT2，并且研究发现，TaUGT2 可能与小麦赤霉病抗性有关，而TaUGT1和TaUGT2可能共同参与了小麦对盐胁迫的响应。秦汉花等[22]将烟草糖基转移酶基因SM-Ngt1转入拟南芥，并接种了油菜菌核病菌，结果表明，拟南芥中SM-Ngt1基因对菌核病具有一定的抗性，且抗性的高低与体内SM-Ngt1的表达量具有明显的一致性。作者前期的研究表明，在低钾胁迫下，NtGT5b的表达量出现了明显的变化，由此说明，烟草糖基转移酶基因可能还会与烟草的矿质营养有关。因此，在本研究中，将该基因的全长克隆出来，以便进一步研究其在烟草矿质营养中的作用，这也是本研究的出发点。由于糖基转移酶所行使的功能较为多样，因此，烟草NtGT5b的克隆只是奠定了对其进行功能研究的基础。对烟草NtGT5b的功能开展深入的研究是下一步的工作重点。

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(责任编辑：常思敏)

CloningandbioinformaticanalysisofglucosetransferasegeneNtGT5bfromNicotianatabacum

REN Xueliang1, LI Liqin2, XU Li2, GUO Yushuang1, LU Liming2

(1.Key Laboratory of Molecular Genetics of CNTC, Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550081, China; 2.College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

For the investigation of tobacco glycosyltransferase, the CDS sequence ofNtGT5b(accession number BAD93690.1), a tobacco glycosyltransferase, was applied, and specific primers were designed accordingly. For the cloning ofNtGT5b, total tobacco RNA was extracted from cultivar K326 leaf, and RT-PCR was performed. Finally, full length CDS sequence ofNtGT5bwas successfully obtained. Bioinformatics analysis showed that the full-length CDS ofNtGT5bwas 1 458 bp, and the encoding protein contained 485 amino acids. Its molecular weight was 54.31 kDa, and the isoelectric point is 5.47. In the secondary structure, the alpha helix and random coil were the main structural forms of the protein, while the extended strand is relatively less. In the three-dimensional structure,NtGT5bmainly consisted of the alpha helix and β-extended strand. This protein is a hydrophilic protein, containing three glycosylation sites and does not contain signal peptides, including glycosyltransferase enzyme family function conserved domain PLN02410, belonging to the GTB type of glycosyltransferase superfamily. It is speculated that this protein has the function of glycosyltransferation.

Nicotianatabacum； glucosyltransferase; gene

2015-01-04

国家烟草专卖局科技项目(110201401007(JY-07))；贵州省烟草科学研究院科技项目(烟草基因遗传转化及表型分析)

任学良(1976-)，男，山西孝义人，研究员，博士，主要从事烟草育种及生物技术研究。

鲁黎明(1965-)，男，河南正阳人，博士。

1000-2340(2016)04-0453-07

S 572

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