化学诱变快速筛选高产甘露醇柠檬明串珠菌株的研究

郑 琳,张鹤之,崔泰花,崔虎山,金 清

(1.延边大学农学院,吉林 延吉 133002; 2.延边大学附属医院,吉林 延吉 133000)

化学诱变快速筛选高产甘露醇柠檬明串珠菌株的研究

郑 琳1,张鹤之1,崔泰花1,崔虎山2,金 清1

(1.延边大学农学院,吉林 延吉 133002; 2.延边大学附属医院,吉林 延吉 133000)

柠檬明串珠菌利用果糖激酶代谢果糖用于细胞生长，从而影响果糖的甘露醇转化。本研究开发了化学诱变法简单、快速、高通量筛选高产甘露醇柠檬明串珠菌突变菌株的方法。甲基磺酸乙酯(EMS)作化学诱变剂改变柠檬明串珠菌中果糖激酶活性来降低果糖代谢，细胞生长则受到抑制，果糖转化为甘露醇提高甘露醇转化量。本试验中首先确定了EMS处理柠檬明串珠菌95的最佳条件，后将EMS处理后的菌株涂布于以果糖为唯一碳源的改良MRS固体培养基上，筛选细胞生长较葡萄糖培养基缓慢的菌株后检测筛选菌株的甘露醇生产能力。试验结果显示，EMS处理的最佳条件为EMS为0.5%，处理时间为45 min。经EMS处理后共有3株诱变菌株符合在果糖培养基和葡萄糖培养基中的生长要求，分别为柠檬明串珠菌95-8、柠檬明串珠菌95-9和柠檬明串珠菌95-12。对3株菌株进行发酵培养，3个菌株的甘露醇生产能力均高于原菌株。

柠檬明串珠菌；甘露醇；甲基磺酸乙酯(EMS)

甘露醇(D-mannitol)是一种六元醇，广泛存在于南瓜、海藻、蘑菇等蔬菜和水果中[1]。甘露醇在食品、制药、医疗和化工行业具有广泛的应用。由于甘露醇的含糖量是蔗糖的50%，不会增加血液中葡萄糖的浓度，因此可作为功能性食品，供减肥者和糖尿病患者食用。将甘露醇添加到口香糖中不仅可以起到甜味剂的作用，同时它还是一种很好的矫味剂和防粘剂。甘露醇在医学上被用作具有强大渗透性的利尿剂，可有效的预防肾功能衰竭[2-3]。工业上甘露醇生产方法主要是葡萄糖/果糖在高温下以雷尼镍为催化剂经高压氢化制得。但这种方法制得的甘露醇含量少，并伴有副产物山梨醇的产生，给甘露醇和山梨醇的分离带来了困难[4]。微生物发酵法可以提高甘露醇的产率并且能避免山梨醇等副产物的产生，成为甘露醇生产的主要发展趋势[5]。目前，能够生产甘露醇的微生物有酵母菌[6]、真菌[7]和乳酸菌。乳酸菌中，明串珠菌属[8]、乳杆菌属[9]和酒球菌属[10]被认为是高效利用果糖生产甘露醇的典型异型发酵乳酸菌。明串珠菌将果糖作为电子受体，利用甘露醇脱氢酶生成甘露醇。另外，柠檬明串珠菌中存在果糖的其他竞争性代谢途径，即在果糖激酶作用下将果糖转化为6-磷酸果糖进入磷酸转酮酶途径(PK)进行代谢并利用于细胞生长[11-12]，影响柠檬明串珠菌甘露醇的产量。为提高异型发酵乳酸菌生产甘露醇的能力，本研究中以柠檬明串珠菌95为试验菌株，利用甲基磺酸乙酯(EMS)作为化学诱变剂作用于发酵菌株，抑制果糖激酶活性，从而阻断果糖向其他代谢流的转化，提高甘露醇产量。在以果糖为唯一碳源的改良MRS培养基中筛选生长速率缓慢的菌株后，分析筛选菌株的甘露醇生产能力，达到简便、快速筛选高产甘露醇诱变菌株的目的。该方法简化了诱变菌株筛选过程，也为化学诱变改良菌种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1 试验菌株 柠檬明串珠菌95：延边大学农学院食品科学系食品科学实验室保存菌种。

1.1.2 主要试剂 磷酸氢二钾、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、硝酸银、硫代硫酸钠、乙腈、乙酸乙酯等：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；果糖、甘露醇：分析纯，阿拉丁试剂公司；酵母膏、蛋白胨：青岛海博生物技术有限公司；甲基磺酸乙酯(EMS)：西格玛化学公司；薄层层析板 Silica Gel60-F254：德国Merck 公司。

1.1.3 培养基与溶液 菌种活化与初培养：MRS培养基与MRS肉汤(青岛海博生物技术有限公司)。MRS-果糖固体培养基：5 g·L-1酵母膏，5 g·L-1蛋白胨，20 g·L-1K2HPO4，10 g·L-1果糖，10 mL·L-1盐混合溶液，20 g·L-1琼脂。MRS-葡萄糖固体培养基：5 g·L-1酵母膏，5 g·L-1蛋白胨，20 g·L-1K2HPO4，10 g·L-1葡萄糖，10 mL·L-1盐混合溶液，20 g·L-1琼脂。

产甘露醇发酵培养基：5 g·L-1酵母膏，5 g·L-1蛋白胨，20 g·L-1K2HPO4，30 g·L-1果糖，10 mL·L-1盐混合溶液。

盐混合溶液：20 g·L-1MgSO4·H2O，1 g·L-1NaCl，2 g·L-1FeSO4，14 g·L-1MnSO4，13 g·L-1CaCl2·H2O。

1.2仪器与设备

NU-9668E超低温冰箱，美国NUAIRE公司；SW-CJ-IFD型超净工作台，上海新苗医疗器械机械制造有限公司；DNP-9082BS-Ⅲ型电热恒温培养箱，上海新苗医疗设备有限公司；SX-700高压蒸汽灭菌器，日本TOMY公司； Z 400K冷冻离心机，莱比信(中国)科技发展有限公司；U-3900紫外可见分光光度计，日本日立公司。

1.3方法

1.3.1 EMS处理条件的确定 首先检测柠檬明串珠菌生长进入对数期的培养时间后，将培养达到对数期的菌液离心、清洗，溶解于同体积、pH为5.5的柠檬酸缓冲溶液中，用不同含量的EMS分别处理不同时间后，计算菌株的细胞存活率，细胞存活率为30%～50%为最佳EMS处理条件。以不加EMS的菌悬液为对照组，每组3个平行。

1.3.2 化学诱变及诱变菌株的快速筛选 将柠檬明串珠菌95菌株接种到100 mL MRS培养基中培养，培养进入对数期后EMS处理，用缓冲溶液清洗3次，用0.85%的氯化钠溶液进行梯度稀释，将稀释后的菌悬液涂布于MRS-果糖培养基中30 ℃培养24 h，观察菌落的大小，第一轮挑选出形态较小的菌落，然后将小菌落分别点样于MRS-果糖和MRS-葡萄糖培养基中，30 ℃培养24 h。将在MRS-果糖培养基中生长受到抑制，而在MRS-葡萄糖培养基中生长良好的菌株作为果糖激酶被抑制的诱变菌株用于后期发酵实验，以检测诱变菌株的甘露醇生产能力[13]。

1.3.3 发酵试验 为评估诱变菌株的甘露醇生产能力，对筛选出来的诱变菌株进行发酵试验。将保藏的诱变菌株1%的接种到含有3%果糖的产甘露醇发酵培养基中，30 ℃培养24 h，发酵液定期取出用于甘露醇含量的测定。

1.3.4 薄层色谱法检验甘露醇含量 将定期取出的发酵液离心，取上清液用于薄层层析(TLC)。点样量为1 μL，将点好样的层析板放入层析缸中，封盖后展层剂展层至距离顶端1 cm处，将层析板取出自然干燥，同样方法再重复展层2次。展层后的层析板放入硝酸银-丙酮溶液中浸渍5 min，干燥后再放入碱性甲醇中浸渍30 min，此时甘露醇与果糖会出现棕色到黑色的斑点。将板干燥，然后迅速浸入1.5 mol·L-1含有0.08 mol·L-1亚硫酸钠和0.25 mol·L-1亚硫酸氢钠的硫代硫酸钠溶液中。1 min后将板取出，流水洗涤1 min，在白色的背景下出现黑色的斑点。所用展层剂为乙腈-乙酸乙酯-正丙醇-水(体积比为85∶20∶20∶15)。硝酸银-丙酮溶液是将1 mL饱和硝酸银溶液加入到200 mL丙酮中，逐滴加入蒸馏水并不断搅拌，直到白色沉淀消失制得。碱性甲醇溶液是将2 mL 40%氢氧化钠溶液加入到200 mL甲醇中制得[14]。

2 结果与分析

2.1EMS处理条件的确定

通过对柠檬明串珠菌菌株进行梯度稀释，确定了最佳筛选稀释度为10-5。将菌悬液经EMS处理后稀释到10-5，涂抹在含有1%果糖的MRS-果糖培养基中，以不经EMS处理的菌液为对照，对平板进行菌落计数，将处理组的试验结果除以对照组的试验结果，计算菌株的存活率。细胞存活率为30%～50%为最佳EMS处理条件。

不同含量EMS和不同处理时间对菌株存活率的影响结果如图1所示。柠檬明串珠菌95分别用0.5%和1%的EMS分别处理15、30、45、60 min，用0.5%的EMS处理30 min和45 min时，存活率在最佳存活率范围(30%～50%)之内，因此确定EMS处理条件为0.5%EMS，处理45 min。

2.2产甘露醇诱变菌株的筛选

为简便、快速筛选高产甘露醇诱变菌株，将EMS处理后的诱变菌株涂抹于含有1%果糖的改良MRS-果糖固体培养基中，形态小的菌株为初筛菌。假设柠檬明串珠菌的果糖激酶基因发生诱变，果糖为唯一碳源的培养基中影响果糖转化为6-磷酸果糖，进一步影响磷酸转酮酶途径(PK)代谢，细胞生长就会受到抑制，果糖代谢转向产甘露醇途径。如果采用这种筛选方法，在第一次筛选过程中将很快的通过观察培养基中诱变处理菌株的生长状态，筛选出菌落小的菌株为果糖激酶基因发生诱变的菌株。将筛选菌株分别接种于MRS-果糖培养基和MRS-葡萄糖培养基中培养，筛选果糖培养基中生长受到抑制，葡萄糖培养基中长势良好的菌为目标菌株，用于甘露醇生产的发酵试验。在进行复筛的同时排除两种情况，一种是经EMS诱变后在果糖培养基和葡萄糖培养基中生长都受到抑制的菌株，另一种是菌株在突变后重新利用果糖激酶在果糖培养基中长势良好的菌株。菌株的筛选结果如图2所示。经过初筛，共有13株突变菌株在果糖培养基中生长受到抑制，将这些菌株进行复筛，通过比较可以看出，柠檬明串珠菌95-8、柠檬明串珠菌95-9和柠檬明串珠菌95-12这3株诱变菌株符合在2种培养基中的生长要求，用于下一步甘露醇发酵试验。

图1 EMS不同处理条件对柠檬明串珠菌95菌株存活率的影响Fig.1 Effects of different EMS treatment conditionson the survival rate of Leuconostoc citreum 95

图2 EMS诱变处理筛选果糖培养基生长受到抑制、葡萄糖培养基生长良好的柠檬明串珠菌诱变菌株Fig.2 Selection of Leuconostoc citreum mutant strainsshowing poor growth on fructose medium but not onglucose medium with EMS treatment

2.3甘露醇生产能力的比较

为分析筛选诱变菌株的甘露醇生产能力，将筛选菌株接种到含有3%果糖的产甘露醇发酵培养基中，30 ℃培养24 h，每隔4 h取样，用薄层层析法比较了不同培养时间柠檬明串珠菌菌株的甘露醇生产能力，结果如图3所示。

图3 柠檬明串珠菌95原菌株与诱变菌株甘露醇薄层层析结果Fig.3 Mannitol production by thin-layer chromatographyin wild-type Leuconostoc citreum 95 and its mutant strains

比较诱变菌株与原菌株在层析板中甘露醇样点的大小与深浅，柠檬明串珠菌95-9菌株的甘露醇样点明显比95的大，且颜色也深，说明诱变菌株在发酵过程中在甘露醇脱氢酶的催化作用下有效地将果糖转化为甘露醇，抑制了果糖激酶的活性，从而降低了果糖向其他代谢产物的转化，提高了果糖的利用率和甘露醇的产量。其他筛选的2个诱变菌株柠檬明串珠菌95-8和 95-12的甘露醇生产能力也均高于原菌株。比较诱变菌株与原菌株在层析板中甘露醇样点的大小与深浅，诱变菌株的甘露醇样点均比原菌株的大，说明诱变菌株在发酵过程中在甘露醇脱氢酶的催化作用下有效地将果糖转化为甘露醇，抑制了果糖激酶的活性，从而降低了果糖向其它代谢产物的转化，提高了果糖的利用率和甘露醇的产量。3株诱变菌株中95-9的甘露醇样点较其它2株菌株要深，其次为95-12和95-8，由此可知诱变菌株95-9的甘露醇生产能力最高，可对其做进一步的研究。

3 结论与讨论

为了简便、快速地筛选出高产甘露醇的柠檬明串珠菌诱变菌株，用EMS作为化学诱变剂，对柠檬明串珠菌95进行了化学诱变，利用MRS-果糖培养基和MRS-葡萄糖培养基筛选了果糖培养基生长缓慢、葡萄糖培养基中生长良好的菌株。

用EMS处理柠檬明串珠菌菌株的最佳条件为EMS为0.5%，处理时间为45 min。经EMS处理后共有3株诱变菌株符合在果糖培养基和葡萄糖培养基中的生长要求，分别为柠檬明串珠菌95-8、柠檬明串珠菌95-9和柠檬明串珠菌95-12。3个诱变菌株的甘露醇生产能力均高于原菌株。

本试验只对高产甘露醇的诱变菌株进行了筛选，对于诱变菌株的生理、形态特征以及诱变菌株中果糖激酶的活性变化还需要做进一步的研究。经EMS化学诱变，利用MRS-果糖培养基和MRS-葡萄糖培养基，通过2种培养基种菌落生长特性比较，直观地筛选出了高产甘露醇的柠檬明串珠菌诱变菌株，此方法简便、快速，有望应用于菌株的改良和育种。

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(责任编辑：蒋国良)

StudyonrapidscreeningofhighyieldingmannitolLeuconostoccitreumusingchemicalmutagenesis

ZHENG Lin1, ZHANG Hezhi1, CUI Taihua1, CUI Hushan2, JIN Qing1

(1. College of Agronomy, Yanbian University, Yanji 133002， China; 2. Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, China)

Leuconostoccitreummetabolizes fructose using fructose kinase for cell growth to affect the conversion of fructose to mannitol. In the present study, we produced a simple, rapid and high-throughput method to screen the high yielding mannitolLeuconostoccitreum. As a chemical mutagen, ethyl methane sulfonate (EMS) changes the fructose kinase activity in theLeuconostoccitreumto reduce the fructose metabolism, inhibit cell growth, and subsequently convert fructose to mannitol and increase the amount of mannitol production. In the present study, we first identified the optimal condition of EMS treatment ofLeuconostoccitreum95, and then applied the EMS-treated strain on the modified MRS solid medium taking the fructose as the unique carbon source, screened the strain making the cell growth become slower than that in the glucose medium, and at last detected the mannitol-producing capacity of the screened strain. The result of our experiment showed that the optimal condition of EMS treatment was 0.5% EMS concentration with a treatment period of 45 min. After being treated with EMS, a total of three mutant strains, includingLeuconostoccitreum95-8,Leuconostoccitreum95-9, andLeuconostoccitreum95-12, were consistent with the requirement of growth in the fructose medium and glucose medium. Fermentation culture of these three strains showed that the capacities of these strains were higher than that of the original strain.

Leuconostoccitreum; mannitol; ethylmethyl sulfonate(EMS)

2015-11-19

国家自然科学基金资助项目 (31260362)

郑琳(1990-)，女,吉林集安人，硕士研究生,从事食品微生物发酵方面的研究。

金清(1971-),女,吉林延吉人，副教授,博士。

1000-2340(2016)04-0516-05

TS201.3

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