石油污染土壤的微生物修复及其去毒效果研究

王朝明,陈俊培,胡 绳，张方亮，张连胜,李烜桢

(1 河南省水文地质工程地质勘察院有限公司，河南 郑州 450003； 2 山东省冶金设计院股份有限公司，山东 济南 250101； 3 河南农业大学林学院，河南 郑州 450002)

石油污染土壤的微生物修复及其去毒效果研究

王朝明1,陈俊培1,胡 绳2，张方亮1，张连胜1,李烜桢3

(1 河南省水文地质工程地质勘察院有限公司，河南 郑州 450003； 2 山东省冶金设计院股份有限公司，山东 济南 250101； 3 河南农业大学林学院，河南 郑州 450002)

从中原油田石油污染土壤中分离到1株石油降解菌HNS-2，经16S rDNA序列分析鉴定为芽孢杆菌属。该菌在10 d内降解56.7%的石油，该菌对土壤中石油具有一定的降解能力，60 d 可降解46.3%的石油，添加营养剂、秸秆、十二烷基硫酸钠以及进行扰动处理均可促进菌株对石油的降解，其中以“连续投加菌剂+营养剂+秸秆”处理的效果最佳，降解率可达66.1%。通过萝卜种子发芽试验，比较了不同处理对石油污染土壤的去毒效果，结果发现石油的降解率与发芽率基本一致，其中以“菌剂+营养剂+秸秆+扰动”处理的发芽率最高。

微生物；降解；石油；土壤；修复

石油是原油和石油制品的总称，是一种由多种烃类及少量非烃化合物和有机金属组成的复杂混合物。据统计，中国每年约有60多万t的石油及其制品通过各种途径进入环境，污染土壤、地下水、河流、海洋[1]。石油进入土壤后可引起一系列不良反应，如通透性降低，肥力下降；阻碍根系呼吸与水分吸收，引起根系腐烂；改变土壤微生物数量和种群多样性等[2]。因此，石油污染已引起人们的高度关注。对于土壤中的石油污染，目前有物理、化学和生物方法将其去除。物理和化学方法虽然见效快，但是成本较高，而且容易造成2次污染，因此限制了其在土壤修复中的应用[3]。生物方法多采用微生物对石油进行降解，该方法成本较低，而且不会造成二次污染，有望成为具有广阔应用前景的修复方法[4]。

本研究从中原油田土壤中筛选得到1株高效石油降解菌，比较了不同强化措施对菌株降解土壤中石油的影响，为石油污染土壤原位修复奠定了基础。

1 材料与方法

1.1试验材料

石油污染土壤采自中原油田，用于分离石油降解菌。萝卜种子(翠绿1号)由河南农业大学赠送。秸秆采自河南农业大学农场。

石油培养基成分为：石油10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaNO30.5 g， MgS04·7H2O 0.2 g，KH2PO41.0 g，NaH2PO4·H2O 1.0 g，CaCl2H2O 0.02 g，蒸馏水1 L，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。

固体培养基在石油培养基基础上添加18g·L-1琼脂粉，121 ℃灭菌20 min即可。

液体培养基：葡萄糖5 g，NH4NO32 g，K2HPO40.5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，无水CaCl20.02 g，NaCl 5 g，FeCl3·6H2O 0.02 g，蒸馏水l L，自然pH值，105 ℃灭菌20 min。

营养剂：KH2PO42 g，NH4NO32 g，蒸馏水1 L。

1.2降解菌株的筛选

取1 g石油污染土壤添加到100 mL石油培养基中，避光培养(28 ℃，180 r·min-1)7 d后，转接于新的石油培养基中继续培养，如此反复5 次。取0.1 mL 培养液均匀涂布在含固体培养基的平板上，30 ℃避光培养，每天观察菌落生长情况。待菌落长出，挑选形态不同的菌落转接到新的含固体培养基的平板上，如此反复数次，直到形成形态单一的菌落，即为纯化的菌株，4 ℃保存，备用。

将上述菌株接种于100 mL液体培养基中，培养1周(30 ℃、180 r·min-1)。取1 mL菌液(OD=0.8)接种于100 mL石油培养基中，建立降解体系并进行培养(30 ℃、180 r·min-1)，10 d后分析降解体系中石油含量，以不接菌的处理作为对照，每个处理设3个重复，比较不同菌株的石油降解能力。

1.3菌株鉴定

将纯化后的菌株接种于液体培养基培养7 d(28 ℃)，观察形态特征，采用DNA提取试剂盒(TIANGEN公司)提取菌株总DNA；采用引物27F及1492R进行石油降解菌的16S rDNA片段的PCR扩增，PCR反应条件为：94 ℃预变性8 min，94 ℃变性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，34个循环，最后72 ℃继续延伸8 min，4 ℃保存。PCR产物由北京美亿美生物技术有限公司进行测序，测序结果导入GenBank数据库中，通过BLASt进行同源性比较。

1.4菌株对土壤中石油的降解

秸秆收获后，用去离子水清洗3次，烘至恒重(60 ℃)，采用粉碎机充分粉碎后备用。 取老化的石油污染土壤200 g装入玻璃杯中，按照表1进行处理，维持田间最大持水量的60%，暗室培养(30 ℃)

表1 试验处理Table 1 Treatments of experiment

注：菌株接种于石油培养基，避光培养7 d(180 r·min-1，30 ℃)即为菌剂；处理6中在培养第30 天第2次添加菌剂；处理8中扰动处理即每周翻土1次；SDS为十二烷基硫酸钠；TX-100为曲拉通 X-100。

Note：The microbial inoculum was made by incubation of strain in the culture contained oil after 7 d under 180 r·min-1，30 ℃. In treatment 6, the microbial inoculum was added twice on the 30th incubation day. In treatment 8, the soil was dug each week. SDS presented sodium dodecyl sulfate. TX-100 presented triton-100.

60 d，取样分析石油含量。每个处理设4个重复，以不添加菌剂和其他化学物质的处理作为对照。试验分2批，一批用于石油含量分析，另一批进行种子发芽试验。

1.5土壤石油含量分析

采用质量法分析石油含量[5]。具体方法为：称取5.00 g风干土样于50 mL离心管中，加入20 mL二氯甲烷，密封，超声提取15 min，离心(4 000 r·min-1)10 min，将上清液倒入烘至恒重的烧瓶中，重复萃取，如此反复3次，将上清液全部倒入烧瓶中，54 ℃旋转蒸发至干，在通风橱内挥发至恒重，称重测量。

1.6种子发芽试验

取30 g 处理后的土壤平铺于培养皿，播种20粒水萝卜种子，表层敷上2～3 mm 厚土壤，维持最大田间持水量的60%，在恒温培养箱内培养，光照时间为8 h， 温度25 ℃。培养第10天 统计种子发芽数， 并计算发芽率。

1.7数据统计

采用SPSS13.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1不同菌株对石油的降解能力

经过初步筛选得到4株形态不同的菌株，分别命名为HNS-1、HNS-2、HNS-3和HNS-4。通过摇瓶试验比较了4株菌对石油的降解能力(表2)，发现

HNS-2对石油的降解率最高，达到45.2%。

表2 不同菌株对石油的降解能力Table 2 Oil degradation of different strains

2.2菌株鉴定

对分离到的石油降解菌HNS-2进行形态观察，发现菌株菌落圆形，边缘整齐，无色透明，光滑有光泽，呈半粒水珠状，粘稠有弹性，菌体杆状，大小为0.80～1.5 μm×2.4～5.0 μm。提取该菌DNA，经PCR扩增、16S rDNA测序，然后通过BLAST检索并与Genebank中序列进行比对，发现该菌基因序列与Bacillussp. 较为相似(图1)，从图1可知该菌属于芽孢杆菌属。

2.3菌株HNS-2对石油的降解

通过摇瓶试验研究了菌株HNS-2对石油的降解能力(图2)，结果发现，该菌可以以石油为唯一碳源生长。在0.5%～2.5%内，随着石油的浓度的增加，降解率逐渐降低。石油的质量分数为0.5%时降解率最高，为56.7%，较另一株芽孢杆菌属H1的降解率(35%)高[2]，由此可见，菌株HNS-2具有较强的石油降解能力，有望用于石油污染的修复。

图1 菌株HNS-2的系统发育树Fig. 1 Phylogenetic tree based on 16s rDNA sequences of the strain HNS-1

含有同一字母的处理表示在0.05水平上差异不显著。下同。The treatments with the same letter are not significantly different (P>0.05).The same as below.

2.4菌株HNS-2及不同强化措施对石油污染土壤修复效果

通过微宇宙试验研究了菌株HNS-2对石油污染土壤的修复效果，以及不同强化措施对该过程的影响(图3)。从图3可知，有21.1%的石油被去除，这有可能是土著微生物的降解作用造成的。处理3石油降解率显著高于对照，达到46.3%，表明添加菌剂显著提高了石油的降解率，菌株HNS-2具有降解土壤中石油的能力。处理4石油降解率为52.5%，高于处理3，表明添加营养剂一定程度上提高了菌株的石油降解率，有可能是营养剂中的氮和磷营养刺激了微生物代谢活性造成的。多项研究表明，在微生物修复石油污染土壤的过程中，

图3 菌株HNS-2及不同强化措施对污染土壤的修复效果Fig. 3 Remediation efficiency of oil contaminated soil bystrain HNS-2 with different augmentation measures

合适的C∶ N∶ P比非常重要，以约100∶ 10∶ 0.3左右为宜[6]，而对于多数老化石油污染土壤，碳元素含量过高，而氮和磷容易亏缺，由此可见适当的补充氮磷营养是一种重要的石油污染土壤修复措施。同时发现菌剂与营养剂的联合作用(处理4)大于单一营养剂(处理2，40.2%)，提示菌株HNS-2在石油污染土壤修复中发挥了重要作用。处理5的降解率(56.3%)高于处理4，表明添加秸秆一定程度上提高了石油的降解率，可能是由于秸秆增加了土壤的通气度，从而提高了微生物的代谢活性。处理6的降解率(50.5%)低于处理5，而处理8的降解率(66.1%)显著高于处理5，表明投菌量对修复效果的影响较大，连续投菌有利于石油降解。处理7的降解率(60.2%)高于处理5，表明扰动可提高石油的降解率，与杨金凤等[7]的研究结果一致。事实上，翻耕土壤是一种常用辅助修复措施，其原理是通过增加土壤中氧气的含量提高修复效率[8-10]，这一现象在本研究中得到进一步验证。处理9的降解率(61.5%)高于处理5，而处理10的降解率(52.5%)低于处理5，SDS的效果优于TX-100。石油属于疏水性污染物，为了增加石油的生物可利用性，人们常常通过添加表面活性剂提高石油的降解率[11-14]，本研究结果表明，并非每种表面活性剂均可促进石油降解，有可能与表面活性剂本身毒性有关。

由此可知，采用微生物修复石油污染土壤是有效的，其修复效果与投菌量有较大关系，连续投菌有助于石油的降解；添加营养剂、秸秆和对土壤进行扰动，均可在一定程度上强化修复效果。

2.5不同强化措施对石油污染土壤的去毒效果

土壤中石油的降解并不一定意味着毒性的去除，石油的中间代谢产物仍可能存在毒性，如作为石油主要成分的多环芳烃，被降解后其产物仍具毒性[15]，因此在实际修复过程中应对石油污染土壤做毒性评价，以确定不同修复措施的去毒效果。本研究通过萝卜种子发芽试验，评价了微生物修复及其强化措施对土壤的去毒效果(图4)，研究发现，石油降解率与种子发芽率基本相符，即降解率越高，种子发芽率也越高，如对照中仅有42.1%的种子发芽率，而石油降解率较高的处理2和处理3的发芽率分别为55.2%和59.5%，均高于对照。但是，也存在一些特殊现象，如处理7的降解率低于处理8，而发芽率恰恰相反，这有可能是石油污染土壤经过通风处理后，其中间产物更容易被土著菌代谢，从而更为有效地去除了毒性。由此可见，通风对石油污染具有较好的去毒效果。

图4 菌株HNS-2及不同强化措施对污染土壤的去毒效果Fig. 4 Detoxifcation efficiency of oil contaminated soil bystrain HNS-2 with different augmentation measures

3 结论

从中原油田石油污染土壤中分离到1株石油降解菌HNS-2，经16S rDNA序列分析鉴定为芽孢杆菌属。该菌可以以石油为唯一碳源进行生长，在10 d内降解56.7%的石油。该菌对土壤中石油具有一定的降解能力，60 d 可降解46.3%的石油，添加营养剂、秸秆、SDS以及进行扰动处理均可促进菌株对石油的降解，其中以“连续投加菌剂+营养剂+秸秆”处理的效果最佳，降解率可达66.1%，而添加TX-100未能提高降解率。通过种子发芽试验发现，石油的降解率与去毒效果基本一致，其中以“菌剂+营养剂+秸秆+扰动”的联合去毒效果最佳。

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(责任编辑：朱秀英)

Microbioremediationofoilcontaminatedsoilanditsdetoxificationeffects

WANG Chaoming1， CHEN Junpei1， HU Sheng2， ZHANG Fangliang1， ZHANG Liansheng1，LI Xuanzhen3

(1.Henan Province Hydrogeology and Engineering Geology Exploration Institute Co., Ltd., Zhengzhou 450003,China； 2.Shandong Province metallurgical engineering Co., Ltd., Jinan 250101, China； 3.College of Forestry, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

A strain HNS-2 with oil degrading ability was isolated from soil in Zhongyuan oil field. The strain was identified asBacillussp. based on the 16S rDNA sequencing analysis. The strain HNS-2 could grow with oil as the sole carbon source and degrade 56.7% of the oil within 10 d in liquid system. In case of soil, the strain could degrade 46.3% of the oil within 60 d. All treatment of addition of nutritional agents, straw, sodium dodecyl sulfate and disturbance could improve the oil degradation. The maximal degradation rate (66.1%) was observed under treatment of “addition microbial inoculum successively + nutritional agents + straw”. The germination test was performed to evaluated detoxification efficiency of different remedial treatment using radish seed. The results showed that oil degradation rate was nearly agreement with germination percentage. However, the highest germination percentage was observed under treatment of “microbial inoculum + nutritional agents + straw + disturbance”.

microorganism； degradation； oil； soil； remediation

2015-05-19

濮阳市中原油田(五厂)石油污染重点区土壤修复项目(2012)512号

王朝明(1976-)，男，河南周口人，主要从事环境微生物研究。

张连胜(1963-)，男，河南兰考人，教授级高级工程师。

1000-2340(2016)04-0558-05

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