荚膜组织胞浆菌病诊断及与结核病鉴别诊断方法的实验研究

郭天芳， 王 璞， 陈保文， 王国治， 罗永艾， 徐 苗， 沈小兵， 苏 城

·论著·

荚膜组织胞浆菌病诊断及与结核病鉴别诊断方法的实验研究

郭天芳1， 王 璞2， 陈保文3， 王国治3， 罗永艾2， 徐 苗3， 沈小兵3， 苏 城3

目的 探讨荚膜组织胞浆菌病（HP）诊断及其与结核病鉴别诊断的方法。方法 提取荚膜组织胞浆菌素纯蛋白衍生物（P-HTPM），以P-HTPM、荚膜组织胞浆菌素国外参考品和结核菌素纯蛋白衍生物（TB-PPD）为研究试剂，以荚膜组织胞浆菌和结核分枝杆菌免疫的豚鼠和小鼠及其血清为实验对象，采用皮肤试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金免疫层析试验（GICA） 3种方法进行HP诊断及与结核病鉴别诊断的研究。结果 成功提取P-HTPM，蛋白纯度为85.8%；P-HTPM与国外参考品的皮肤反应结果一致（P＞0.05），1 mg/L 的P-HTPM与国外参考品等效，P-HTPM与TB-PPD对致敏豚鼠皮肤试验无交叉反应；包被P-HTPM的ELISA检测小鼠抗荚膜组织胞浆菌血清全为阳性，检测抗结核分枝杆菌血清和正常小鼠血清结果均为阴性（P＜ 0.01）；以P-HTPM抗原为检测线的GICA试纸条检测小鼠抗荚膜组织胞浆菌血清灵敏度为100%（14/14），特异度为93.8%（15/16）。结论 以P-HTPM为抗原的动物皮肤试验、ELISA和GICA对HP的诊断及其与结核病的鉴别诊断有重要价值。

荚膜组织胞浆菌病； 结核病； 诊断与鉴别诊断

荚膜组织胞浆菌病（Histoplasmosis，HP）是一种世界范围内流行的传染性系统性真菌病，可引起肺部和全身感染，临床表现无特异性，误诊率高，尤其是慢性肺型HP与肺结核病在临床表现和X线表现上都很相似。我国为结核病高发国，痰菌阴性结核越来越多，国内也有关于荚膜组织胞浆菌（Histoplasma capsulatum）感染致肺型HP误诊为肺结核的临床病例报道。加强对HP诊断及其与结核病鉴别诊断方法的研究成为必要。最近，中国食品药品检定研究院成功研制出具有自主知识产权的荚膜组织胞浆菌素纯蛋白衍生物（purified protein derivative of histoplasmin，P-HTPM），本研究以该P-HTPM为基础，分别采用皮肤试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）和胶体金免疫层析试验（GICA），对HP进行诊断方法的系统研究以及其与结核病的鉴别诊断研究。

1 材料与方法

1.1 材料

荚膜组织胞浆菌：购自美国组织培养物保藏所（ATCC），编号12700；荚膜组织胞浆菌素（Histoplasmin， HIMN）国外参考品（以下简称“ 国外参考品”）： 1∶100稀释液（Histoplasmin，Diluted），美国PARK-DAV公司生产；结核菌素纯蛋白衍生物（TB-PPD）：批号990624，北京祥瑞生物医药有限公司生产；兔IgG（10 g/L）：购自北京中杉金桥生物技术公司；葡萄球菌蛋白A（SPA）：由上海奥普生物医药有限公司赠与。实验动物：Balb/C小鼠，8～10周龄，雌性；白色雌性豚鼠，体重400～600 g/只，均购自中国食品药品检定研究院实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 P-HTPM提纯 将荚膜组织胞浆菌菌种接种于葡萄糖甘油液体培养基25 ℃静置培养8周以上。培养物经高压灭菌后离心除去菌体，收集培养滤液，参考胞内分枝杆菌变态反应原提取方法发明专利技术［1］，采用三氯醋酸和硫酸铵沉淀法进行提纯，再经透析、过滤除菌，即为P-HTPM母液，经蛋白质含量测定后将母液稀释至1 g/L，为本研究中所用P-HTPM原液，分装，4 ℃保存。按2005年版《中华人民共和国药典·三部》进行蛋白纯度，即蛋白含量/（蛋白+多糖+核酸总含量）测定。

1.2.2 豚鼠皮肤试验 ①比较P-HTPM与国外参考品对致敏豚鼠皮肤反应的效价。将P-HTPM原液稀释成1、 2、 4、 8 mg/L，作为皮肤变态反应原试验样品，国外参考品作为阳性对照。经荚膜组织胞浆菌致敏的豚鼠6只，每只豚鼠皮内注射上述5个样品各0.2 mL，去毛后以轮圈法注射于豚鼠背部两侧。记录48 h皮肤局部硬结直径大小，皮试结果判断标准：局部硬结直径≥5 mm判为阳性。计算硬结平均值。②P-HTPM与TB-PPD对致敏豚鼠的皮肤反应以17只结核分枝杆菌致敏豚鼠和12只荚膜组织胞浆菌致敏豚鼠为试验对象，5只正常豚鼠为空白对照。每只豚鼠皮内注射国外参考品、 P-HTPM（1 mg/L）及TB-PPD（50 U/mL）各0.2 mL。记录48 h皮肤局部硬结直径，结果判断标准同1.2.2①，计算硬结直径平均值，了解两种变态反应原对机体有无皮肤交叉反应。

1.2.3 ELISA检测小鼠免疫血清抗体 ①ELISA检测小鼠荚膜组织胞浆菌免疫血清抗体方法的建立。用结核分枝杆菌和荚膜组织胞浆菌菌体抗原分别免疫小鼠，每2周1次，共2～4次，制备小鼠荚膜组织胞浆菌和结核分枝杆菌免疫血清。以P-HTPM为包被抗原，采用方阵滴定法，梯度稀释P-HTPM为40、 20、 10、 5 mg/L的溶液，分别包被96孔板（100 μL/孔）；稀释小鼠荚膜组织胞浆菌免疫血清为1∶100、1∶1 000、1∶10 000待检样品，加入不同抗原浓度包被的96孔板（100 μL/孔），自动酶标仪测定各孔光密度（D）值，确定抗原抗体最适工作浓度。判断标准：D值≤2.1倍阴性血清D值判为阴性；D值＞2.1倍阴性血清D值判为阳性。②包被P-HTPM与TB-PPD抗原检测免疫血清效价。分别包被最适剂量的P-HTPM和TBPPD，以正常小鼠血清为阴性对照，用ELISA检测13份小鼠结核分枝杆菌免疫血清和8份荚膜组织胞浆菌免疫血清的效价，观察有无交叉反应。结果判断同1.2.3①。

1.2.4 GICA检测小鼠免疫血清抗体 ①GICA检测小鼠荚膜组织胞浆菌免疫血清抗体方法的建立。首先制备胶体金，再用10 mg/L SPA在弱酸下致敏胶体金形成免疫胶体金复合物，制备好检测时需用的免疫胶体金。用自动喷膜机在硝酸纤维素膜（NC，Millipore公司）上喷P-HTPM抗原作为检测线（T线），喷4 g/L兔IgG作为质控线（C线）。分别喷膜1、 2、 5 g/L（均含2% BSA）的P-HTPM以确定抗原最适剂量。将上述NC膜配以玻璃纤维，组装切割制备层析法试纸条。检测时在试纸条上先后滴加小鼠荚膜组织胞浆菌免疫血清和免疫胶体金， 20 min内观察结果。结果判断标准：T线和C线均呈现红色为阳性；只有C线呈红色为阴性，只有T线呈红色则结果不可靠，需重新检测。②GICA检测14份小鼠荚膜组织胞浆菌免疫血清。制备最适抗原量的免疫层析试纸条，检测免疫血清中抗体。结果判断标准同 1.2.4①。③GICA检测16份小鼠结核分枝杆菌免疫血清，用 1.2.4②中的试纸条检测结核分枝杆菌免疫血清，结果判断标准同 1.2.4①。

1.2.5 统计学处理 采用Minitab软件进行统计分析，两组间的比较用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P-HTPM原液蛋白纯度

用Lowry法测定蛋白质含量为0.97 g/L、蒽酮法测定多糖含量为0.15 g/L、紫外分光光度法测定核酸含量为0.01 g/L，计算蛋白纯度为85.8 %。

2.2 P-HTPM效价

与国外参考品皮肤反应的效价比较：P-HTPM对荚膜组织胞浆菌致敏豚鼠皮肤试验均呈阳性反应，1、 2、 4、 8 mg/L的 P-HTPM及国外参考品硬结平均直径分别为（9.8±0.2）、（10.2±0.2）、（11.5±0.3）、（12.5±0.3）、（9.9±0.2） mm，P-HTPM与国外参考品皮肤反应结果一致（P＞0.05），其中1 mg/L 的P-HTPM与国外参考品等效。

2.3 P -HTPM与TB-PPD的皮肤交叉反应情况

P-HTPM对荚膜组织胞浆菌致敏豚鼠皮肤反应均为阳性，硬结平均值为（10.6±0.2）mm，对结核分枝杆菌致敏豚鼠皮肤反应均为阴性，两者比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）；TB-PPD对荚膜组织胞浆菌致敏豚鼠皮肤反应均为阴性，对结核分枝杆菌致敏豚鼠皮肤反应均为阳性，硬结平均直径（12.7±0.5）mm，两者的差异有统计学意义（P＜0.01）。提示P-HTPM与TB-PPD这两种变态反应原皮肤试验无交叉反应。结果见表1。

表1 P-HTPM与TB-PPD变态反应原对豚鼠的皮肤反应（硬结）Table 1 The skin reaction in guinea pigs using purified protein derivative of histoplasmin and tuberculin purified protein derivative as allergen ［diameter of induration， mm （%）］

2.4 ELISA方法检测血清抗体

①P-HTPM和血清最适工作浓度为10 mg/L、1∶1 000。②分别包被P-HTPM和TB-PPD的ELISA检测小鼠免疫血清中抗体，无交叉反应出现，结果见表2。 P-HTPM检测8份小鼠荚膜组织胞浆菌免疫血清全部为阳性，D值为0.993 ± 0.216，检测13份小鼠结核分枝杆菌免疫血清和8份正常血清全为阴性，P＜0.01；TB-PPD检测结核分枝杆菌免疫D值为1.606 ± 0.263，而检测荚膜组织胞浆菌免疫血清结果全为阴性，P＜0.01。③PHTPM包被的ELISA检测小鼠血清荚膜组织胞浆菌抗体，灵敏度8/8，特异度100 %（13/13）。

2.5 GICA检测血清抗体

①分别用在T线处喷膜1、 2、 5 g/L的P-HTPM制备的试纸条检测荚膜组织胞浆菌免疫血清时，3种试纸条的T线和C线均呈现红色，全部检出结果为阳性。T线颜色随喷膜抗原浓度的增加而加深，但三者间肉眼观察无显著差别，弱阳性标本用1 g/L试纸条检测时呈色相对较弱，故选择2 g/L为最适喷膜抗原浓度。②喷2 g/L的P-HTPM为T线的试纸条检测14份小鼠荚膜组织胞浆菌免疫血清结果，见图1，全部血清标本结果均为阳性，灵敏度100 %（14/14）。T线呈色的强弱与抗体效价高低呈正相关，与ELISA检测结果相一致，D值越大的血清标本呈色越明显。用该试纸条检测16份小鼠结核分枝杆菌免疫血清结果，见图2，其中15份为阴性，1份为阳性，特异度93.8 %（15/16）；检测8份正常小鼠血清，结果全为阴性。

表2 P-HTPM和TB-PPD为包被抗原ELISA检测血清效价（D值）Table 2 Antibody titer in ELISA detection of antibodies to P-HTPM-coated and TB-PPD-coated antigen （D value ）

图1 GICA试纸条检测14份小鼠抗荚膜组织胞浆菌血清结果Figure 1 Results of gold immunochromatography assay for antibodies to Histoplasma capsulatum in the sera of 14 mice

图2 GICA试纸条检测16份小鼠抗结核分枝杆菌血清结果Figure 2 Results of gold immunochromatography assay for antibodies to Mycobacterium tuberculosis in the sera of 16 mice

3 讨论

约95 % HP为无症状型， HP在我国的高漏诊率和高误诊率应当引起临床医务人员的高度重视。HP确诊依据为真菌的培养分离，但至少需4个月，且阳性率低［2］。国外发展了一些如ELISA、PCR等比较快速的辅助诊断方法，国内尚未见到关于HP诊断的系统研究的报道。根据机体抗真菌免疫作用与分枝杆菌相似，均可引起细胞免疫和体液免疫这一理论，我们在自主研制的P-HTPM的基础上，开展了皮肤试验、ELISA及GICA检测血清抗体等多种方法对HP的诊断及其与结核病的鉴别诊断进行探索。

目前，在HP诊断中使用最广泛、时间最长的国外皮肤反应制品为HMIN，是由荚膜组织胞浆菌培养物经洗涤、振荡和过滤所得的滤液制品，类似于旧结核菌素（OT）［3］。该HMIN未以化学方法提纯，含培养基成分且菌体杂质较高，容易引起非特异性反应及不良反应，无法以化学定量法测定有效物质含量，量效关系难以确定，其灵敏度与特异度均不理想。我们用化学方法成功研制出P-HTPM，其蛋白纯度高达85.8 %，豚鼠皮肤试验显示其1 g/L剂量与国外参考品所诱导的机体免疫应答反应等效，P-HTPM和TB-PPD对致敏豚鼠无皮肤交叉反应，其检测灵敏度为100 %，特异度为100 %。P-HTPM的成功研制有望成为诊断人体荚膜组织胞浆菌感染与HP的体内诊断试剂，为HP大规模流行病学调查和诊断技术的研究奠定了基础；P-HTPM和TB-PPD同时使用时，具有鉴别HP和结核分枝杆菌感染及结核病的重要价值。

近年来，国外研究报道用于诊断HP的ELISA包被抗原主要有3种［4］：HMIN、pHMIN（纯化荚膜组织胞浆菌素）和ptHMIN（处理后的纯化荚膜组织胞浆菌素）。P-HTPM制备方法与HMIN国外参考品不同，主要成份为蛋白质（85.8 %），另含少许多糖（13.3 %）和核酸（0.9 %）。以P-HTPM为包被抗原的ELISA检测小鼠结核分枝杆菌免疫血清无一例阳性结果（0/13）；而用HMIN作包被抗原的ELISA检测结核患者血清时，出现29 %阳性结果［5］，这可能与HMIN蛋白纯度低，含多糖较多，其多糖抗原决定族与结核分枝杆菌发生交叉反应有关。有实验结果显示，以p-HTPM及pt-HTPM为抗原的ELISA检测血清中荚膜组织胞浆菌抗体，特异度为100 %，且其灵敏度也较HMIN提高［6］，可能成为HP与结核病一种有效的诊断和鉴别诊断方法。

免疫胶体金技术是一种以胶体金为示踪标志物的新型免疫标记技术，可用于抗原抗体检测，它克服了ELISA的步骤繁琐及时间长等缺点，具有简单、快速、准确的优点，在各种生物学研究中广泛应用［7-10］，目前应用于医学检验的主要有2种方法： GICA和渗滤法。本研究采用GICA，在T线处喷P-HTPM为抗原检测血清抗体，我们在喷膜抗原时加入2 % BSA，封闭T线处NC膜上未被抗原结合的空白位，从而减少非特异性反应。制备免疫胶体金时常选择蛋白质和其他生物大分子如SPA、PHA、ConA等与胶体金结合，因SPA能与人、小鼠、豚鼠、家兔和狗等多种动物来源IgG的Fc段相结合，将血清中的抗体随胶体金流动带至T线和C线处呈色或（和）不呈色，适用于多种物种来源的血清检测，故我们选择SPA来标记胶体金。免疫胶体金试验检测结果的准确性主要依赖于喷膜抗原的特异性，其次是尽量减少非特异性反应引起的假阳性，本试验特异度为93.8 %，较ELISA方法低，说明喷膜抗原有待于进一步纯化及进一步采取减少非特异性反应的措施。

以上3种试验诊断方法仅仅是动物实验的研究结果，初步显示出对HP诊断及结核病鉴别诊断的价值。关于P-HTPM应用于人体皮肤试验临床研究已获国家药监局批文，我们将进行相关临床试验来验证上述方法的有效性和可行性。

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Experimental study on the diagnosis of histoplasmosis and its differential diagnosis with tuberculosis

GUO Tianfang， WANG Pu， CHEN Baowen， WANG Guozhi， LUO Yongai， XU Miao， SHEN Xiaobing， SU Cheng. （Department of Respiratory Diseases， Jinan Central Hospital， Jinan 250013， China）

Objective To evaluate and compare the utility of several methods for diagnosis of histoplasmosis and its differential diagnosis with tuberculosis. Methods Purified protein derivative of histoplasmin （P-HTPM） was prepared. We developed a skin test in immunized guinea pigs using P-HTPM as allergen to detect the skin reaction， comparing with the reference histoplasmin made in the US and tuberculin purified protein derivative （TB-PPD）. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was developed for detection of anti-Histoplasma antibodies to P-HTPM in the sera of immunized mice. We developed a colloidal gold immunochromatography assay （GICA）to detect anti-Histoplasma antibodies to P-HTPM in the same sera. Results P-HTPM was extracted successfully， the purity of which was 85.8%. P-HTPM at 1 mg/L was equivalent to the reference histoplasmin in inducing the same skin reaction in immunonized guinea pigs （P ＞ 0.05）， while P-HTPM did not induce cross reaction with TB-PPD. ELISA showed that all the sera from the mice immunized with Histoplasma had positive reaction to P-HTPM but negative to TB-PPD， and also negative in the sera of normal control mice （P＜ 0.01）. The sensitivity of GICA test strip was 100% （14/14）in detecting the antibodies to P-HTPM antigen in the sera from the mice immunized with Histoplasma. The specificity of the method was 93.8% （15/16）. Conclusions P-HTPM-based skin test in animals， ELISA and GICA are useful in the diagnosis of histoplasmosis and its differential diagnosis with tuberculosis.

histoplasmosis； tuberculosis； diagnosis and differential diagnosis

R519.8

A

1009-7708（2016）02-0200-05

10.16718/j.1009-7708.2016.02.013

2015-04-26

2015-09-01

国家“863”项目（2004AA2Z3452）。

1. 济南市中心医院呼吸内科 ，济南 250013。

2. 重庆医科大学附属第一医院；

3. 中国食品药品检定研究院菌苗室。

郭天芳（1989—），女，硕士，住院医师，主要从事呼吸道感染性疾病的研究。

王璞，E-mail：miss_miao@163.com。