烟草种质资源遗传多样性与群体结构分析

张铭真，邢雪霞，李晓辉，杨铁钊，徐世晓

（河南农业大学烟草学院，郑州 450002）

烟草种质资源遗传多样性与群体结构分析

张铭真，邢雪霞，李晓辉，杨铁钊，徐世晓*

（河南农业大学烟草学院，郑州 450002）

发掘优良基因，为改良烟草品种提供理论依据。采用ABI-3500xl遗传分析仪对87份烟草种质材料进行多态性检测。在87份烟草种质中，41对SSR引物共检测出241条多态性位点，平均为5.88个位点。遗传相似系数为0.47～0.91，PIC值为0.23～0.91，平均为0.63。群体结构分析表明，当K=2时，△K值最大，即87份烟草材料可划分为2个类群P1和P2，P1类群又可划分为5个亚类，P2类群可划分为2个亚类。烟草种质资源遗传多样性丰富，群体结构划分与种质类型不完全相关。

烟草；SSR荧光标记；遗传多样性；群体结构

烟草是我国重要经济作物之一，目前烟草育种面临亲本匮乏，品种遗传背景狭窄等问题［1］，亟需加强对种质资源的遗传基础的了解。对现有烟草种质材料进行遗传多样性研究，可以选择遗传差异较大的亲本配制杂交组合，减少育种工作量，提高育种效率。同时，寻找与目标性状相关的分子标记，可以为分子标记辅助育种奠定基础。当前，分子标记已开始应用于作物遗传资源及育种研究，分别被称为分子资源鉴定和分子标记育种［2］。随着分子生物学技术的迅猛发展，分子标记技术日趋成熟，目前常用的分子标记有RFLP、SRAP、AFLP、ISSR、SSR等。微卫星（亦称简单序列重复 simple sequence repeats， SSR）技术具有多态性高、数量丰富、重复性好、呈共显性、广泛分布于基因组等优点［3］。Bindle等［4］从Tobacco Genome Initiative公布的烟草基因组序列信息中搜索到282对SSR引物，并利用这些引物构建了烟草遗传连锁图。聂琼等［5］利用SSR和 ISSR技术分析了23份烟草种质遗传多样性。文轲等［6］利用SSR技术，以抗CMV的烤烟品种台烟8号、感病品种NC82为亲本，构建BC1代分离群体，筛选到一个与抗性基因相关的SSR标记，并认为台烟8号对CMV的抗性是由多基因控制。祁建民等［7］应用ISSR技术，对烟草属4个种30份材料进行遗传多样性分析，发现栽培种内的遗传基础相对狭窄。陈雅琼等［8］用36对SSR引物，分析了63份烤烟和8份白肋烟种质的遗传多样性，也表明我国烟草栽培种间的遗传基础狭窄、遗传多样性不丰富。陈杰等［9］结合形态学标记和SSR分子标记对 69份烤烟种质资源进行遗传多样性评价，它们之间的遗传距离在 0.32～7.83，遗传相似系数在0.30～0.96。以往的研究存在研究材料的类型、数量不足、代表面较窄的问题，因此本研究征集不同类型不同来源的烟草种质材料，并基于全自动 DNA遗传分析系统的 SSR荧光标记检测技术，利用Genographer软件精确定量扩增产物的片段长度，对87份烟草种质进行遗传多样性和群体结构研究。确定烟草种质材料间的遗传背景差异与群体结构，为烟草优异基因的发掘、复杂性状关联分析以及拓展烟草育种的遗传基础提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

87份烟草种质资源名称列于表1，种质资源来源于河南农业大学烟草育种实验室和青州烟草研究所。2015年5月取苗期刚长出来的新鲜叶片至于2 mL离心管中液氮冷冻带回河南农业大学烟草育种实验室，从液氮中取出放置于-70 ℃超低温冰箱中保存待用。

1.2烟草总DNA提取和SSR-PCR扩增

样品离心管置于磨样机上，待叶片磨碎后于液氮中迅速冷冻，用TaKaRa新型植物基因组DNA提取试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）提取DNA。用2%琼脂糖凝胶电泳检测质量后保存于-20 ℃冰箱待用。

利用三引物法PCR（在5´端加有M13尾巴序列的特异正向引物、特异反向引物及带有荧光标记的通用型M13引物，利用毛细管电泳技术可以同时检测不同荧光染料标记的多个SSR位点）扩增SSR位点。所用的荧光标记引物是M13-Cy5，序列为5´-CACGACGTTGTAAAACGAC-3´，在合成SSR引物时，在每个正向引物的5´端加上M13尾巴序列，SSR引物由金唯智（苏州）生物科技有限公司合成。正、反向引物的浓度均稀释为10 μmol/L，-20 ℃保存备用。

SSR-PCR反应体系为10 μL，包括：2 μL基因组DNA，0.6 μL Mg2+，1 μL 10×Buffer，0.15 μL dNTP，0.1 μL rTaq酶，带荧光标记的M13正向引物0.1 μL，正向引物和反向引物各0.05 μL，0.15 μL。PCR程序如下：94 ℃ 5 min预变性；94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；94 ℃ 30 s；退火温度各引物不同。

1.3毛细管电泳检测

PCR产物吸取2 μL于加有6 μL变性剂的384孔板中，95 ℃变性5 min。PCR产物用AB公司Genetic Analyzer 3500 xl仪器进行检测。试验结果用Genographer软件进行数据读取。

1.4数据分析

对Genographer软件获得的原始数据转化为0，1格式，建立原始矩阵后用NTSYS-pc 2.10e［10］软件进行后续分析。计算多态性位点百分率P（%）=（k/n）×100，其中k是多态位点数，n为所测位点总数。SSR位点的多态性信息量（PIC）按照如下公式进行计算：PIC=1-∑Pi2，公式中Pi表示第i个等位位点出现的频率。利用 NTSYS-pc Version 2.10e中的Qualitative date模块计算任意两个品种间的相似系数（GS）。以Clustering程序中SHAN进行UPGMA（非加权组平均法）聚类分析，绘制聚类树状图；利用Structure2.3.4［11］软件，采用混合模型进行群体遗传结构分析。

表1　供试材料Table 1 Nicotiana tabacum accession lines investigated in this study

2　结　果

2.1SSR引物多态性分析

从80对引物中筛选出41对多态性较好、扩增带清晰的引物对87份烟草种质进行分析。41对引物在87份烟草种质中扩增出241条多态性条带。各引物多态性条带数为2～24，平均每对引物能扩增到 5.88个多态性片段。各引物的 PIC值变幅为0.23～0.91，平均为0.63（表2）。

2.2烟草种质资源聚类分析

以41对SSR引物的扩增带型为基础，以0，1格式表示，其中数据缺失标记为 2，用 NTSYS-pc2.10e软件进行UPGMA法聚类分析，得出87份种质的聚类图。各种质间遗传相似系数范围为0.47～0.91，其中玉水3号（25）与G70（39）相似系数最大，为0.91，说明亲缘关系很近；密节多叶烟（60）与K326（9）之间的相似系数为0.47，说明这两品种间的亲缘关系较远。在相似系数0.66处，可将87份烟草种质分成5大类。赞比亚1号（香料烟）和T.I.245各成一大类，第3类仅包括Criollo Salteno 11和B-1000，两者间相似系数为0.69。第4大类由Virgina Gold、Ky151、丸叶、青梗、金英、密节多叶烟、红花小黑烟、陈河金堂烟、广杂87号、Basma Llovina、Vranjska Jaka、督叶尖干种、夏湾那13个品种组成。其他品种构成第5大类。在相似系数0.64处可将87份烟草种质分为两大类；Virgina Gold、Ky151、丸叶、青梗、金英、密节多叶烟、陈河金堂烟、广杂87号、Basma Llovina、Vranjska Jaka、督叶尖干种、夏湾那等13个品种为一类，剩余品种为第2类。在不同相似系数处划分会得到不同类型，但是这两种划分都将烤烟类种质聚集为一大类，其中亦会参杂其他类型烟草种质。

2.3供试烟草种质群体结构分析

本研究利用全基因组41个SSR标记对87份烟草品种进行群体结构分析；假定亚群数目 K为1～10，每个K值运行5次模拟运算。随着K值的逐渐增加，软件输出的后验概率LnP（D）值呈连续上升趋势，但LnP（D）值最明显的变化发生在K由1到2的过程中。△K综合考虑了LnP（D）的变化速率和方差，当K=2时，△K出现峰值（图1a）。从上述方法判断，本群体中 87份烟草品种被分成两个类群，P1和P2（图1）。P1类群包含50个烟草品系，在P1类群中，群体结构分析发现，随着K值的逐渐增加，后验概率LnP（D）值呈上升趋势，当K由4 到5时，LnP（D）值变化最为明显。当K=5时，△K出现了峰值（图1b）。因此P1类群中检测到5个亚类群。在P2类群中，群体结构分析发现，随着K值的逐渐增加，后验概率LnP（D）值逐渐上升，当K 由1到2时，LnP（D）值变化最明显，当K=2时，△K出现了峰值（图1c）。因此P2类群中检测到两个亚类群。烟草87个品种的群体结构示意图如图2。

3　讨　论

拓宽烟草遗传基础，发掘优异基因，改良烟草品种是目前我国烟草育种的首要任务，而缺乏对种质资源遗传特点的了解是完成这一任务的最大障碍；目前许多研究者利用各种分子标记技术探讨了烟草资源的遗传多样性与亲缘关系。Moon等［12］利用46对SSR引物对54份烟草属材料进行聚类分析，得到的结果与基于形态细胞学的观察分类结果一致。王志德等［13］用43个RAPD引物PCR扩增出214个DNA片段，将24个烟草种质分为6大类群，并表明其有高度的遗传多样性。梁景霞等［14］用18个ISSR分子标记引物，对96份烟草种质进行PCR扩增，共获得314条稳定条带，并用Nei-Li相似系数法计算其遗传相似系数在0.28～0.97，遗传多样性丰富。Patrizia Bogani等［15］利用15对RAPD引物对42个烟草品系进行遗传多态性研究，结果显示其遗传距离为0.21到0.92。Ren等［16］用AFLP分子标记分析了41个烟草栽培种和7个野生烟草种的遗传多态性，结果表明，烟草种间遗传距离在 0.28～0.58，种间遗传多样性丰富。本研究所用引物平均PIC值达到0.63，这些引物能在某些烟草种质中扩增出特异带型，由此说明这些引物可用于烟草种质遗传多样性。本试验41对SSR引物对87份烟草种质的分析结果表明烤烟内的遗传相似性较高，种间的遗传差异较大，87份烟草品种包含了烤烟、晾晒烟、白肋烟、雪茄烟和香料烟5个栽培类型，较好地表现出了遗传多样性特征，这与以往的研究［17-21］结果相一致。聚类分析图显示，个别品种会偏离原有类型，说明在不同生态条件下，人为目的的长期选择逐渐形成了不同栽培类型；个别品种偏离原有类型，和其他类型聚在一起，主要与亲源关系有关；烟草种质间的遗传差异与品种调制类型、地理来源的差异没有较大的联系。

图1　烟草总群体和不同类群中的后验概率和△K值Fig. 1 Posterior probability and delta k values of tobacco groups and different groups

图2　87个烟草品种的群体结构示意图Fig. 2 Group structure diagram of 87 tobacco varieties

就中美主要烟草品种亲源关系进行研究，发现世界主产烟国家的烟草育种也基本在美国育成品种的基础上发展起来的，各国的主栽品种都有美国品种的亲源成分，我国的烟草育种更不例外［1］；而本研究聚类分析和群体结构分析结果显示美国品种资源在不同亚群间出现一定程度的交叉现象。较高的遗传多样性是维持物种长期生存的基础，为提高烟草品种的产量、品质及抗性，可以利用生物工程的方法实现野生种优良基因向栽培品种转移的目的，从而创造更有利用价值或特殊作用的烟草新品种。

4　结　论

供试烟草种质材料 SSR分子标记揭示了烟草种间存在较丰富的遗传多样性，烤烟品种内遗传基础相对狭窄。少数品种或类型聚类时出现交叉现象，与其亲源关系有关，与地理来源及调制类型关系不大。本研究可为进一步开展烟草种质资源指纹图谱研究及利用种内种间遗传差异较大的材料拓宽烟草遗传基础、发掘有利基因和改良烟草品种提供理论依据。

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Analysis of Genetic Diversity and Population Structure of Germplasm Resources in Nicotiana tabacum

ZHANG Mingzhen， XING Xuexia， LI Xiaohui， YANG Tiezhao， XU Shixiao*
（College of Tobacco Science， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

The population structure and genetic diversity of tobacco provide a theoretical basis for identifying elite genes and improving varieties by breeders. Genetic diversity and population structure of 87 tobacco materials were evaluated using 41 polymorphic SSR markers screened from a total of 80 SSR primer pairs. The amplified fragment length polymorphism was detected by The Applied Biosystems 3500 xl Genetic Analyzer. The results revealed that a sum of 241 polymorphism sites were found using the 41 SSR primer pairs， with an average of 5.88 sites per primer pair. The genetic similarity coefficient ranged from 0.47-0.91， and the PIC averaged 0.63， ranging from 0.23-0.91. Results from the clustering analysis based on a model-based method indicated that when K=2， the largest delta K value， namely 87 tobacco materials can be divided into two groups （P1 and P2， with the P1 group further divided into five classes and the P2 group further divided into two classes. The genetic diversity of tobacco germplasm was abundant and the division of population structure was not completely related to germplasm type.

tobacco； SSR fluorescent markers； genetic diversity； population structure

S572.03

1007-5119（2016）04-0042-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.008

中国烟草总公司重大项目“高抗根结线虫病优质烤烟新品种选育”（110201402004）

张铭真（1992-），女，硕士研究生，研究方向为烟草遗传育种与生理。E-mail：yczhangmingzhen@163.com*通信作者，E-mail：xushixiao@126.com

2016-01-25

2016-03-05