超高效液相色谱-串联质谱法快速测定人体尿液中3种甜味剂

陈 霞, 杨华梅, 杨建国, 张雪梅, 黄为红, 杭 莉

(泰州市疾病预防控制中心，江苏泰州 225300)

人工合成甜味剂(Artificial Sweeteners,Ass)是一类能赋予食品甜味，且在人体内几乎不产生热量的食品添加剂[1]，大多数甜味剂由多种成分复配使用[2]。甜蜜素、糖精钠和安赛蜜均为非营养型甜味剂，具有甜度高、用量少等特点。甜蜜素化学名称为环已基氨基磺酸钠，自1970年Price等人[3]报道甜蜜素对大鼠可诱发膀胱癌后，科学家们对甜蜜素的毒理以及甜蜜素体内代谢机理展开了长期的研究[4，5]。糖精钠化学名称为邻苯甲酰磺酰亚胺钠，从上世纪50年代开始至今，糖精钠安全性就一直存在争议，尤其是糖精钠的致癌性一直受到科学家们的重视。安赛蜜化学名为6-甲基-1,2,3-氧恶嗪-4-(3H)-酮-2,2-二氧化物钾盐(乙酰磺胺酸钾)，1997年Mukherjee等人[6]研究结果显示在给予小鼠更高剂量(60、450、1100和2 250 mg/kg)安赛蜜时，其具有显著致畸性和遗传毒性。尽管我国对甜蜜素、糖精钠和安赛蜜三种甜味剂有着严格的限量标准，但目前许多生产厂家并未严格执行国家标准，导致超标滥用的情况屡屡出现[7,8]。

目前，多种甜味剂含量的测定主要有土壤样品[1]、食品类样品[9 - 11]、污水沉淀物[12]以及环境水样[13,14]，而对人体尿液中甜味剂的测定只有甜蜜素有报道，采用的检测方法主要为柱前衍生高效液相色谱法[15]和柱前衍生气相色谱-质谱法[4]。本研究采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定了人体尿液中甜蜜素、糖精钠和安赛蜜3种甜味剂，与文献报道的方法相比，本方法前处理简单，无需衍生，分析速度快，灵敏度高，达到了定性和定量分析的要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters ACQUITY超高效液相色谱(美国，Waters公司)；AB SCIEX API4000+质谱仪(美国，ABSCIEX公司)；HC-3018R高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)。

甜蜜素、安赛蜜和糖精钠标准品(纯度大于99%，美国Supelco公司)。标准品储备溶液:分别准确称取甜蜜素、糖精钠和安赛蜜标准品各0.1 g(精确至0.1 mg)，各置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，配成1.0 mg/mL标准储备溶液，于4 ℃保存。混合标准工作溶液:分别准确移取适量各标准品储备溶液于同一量瓶中，加水稀释，制成所需浓度的混合标准工作溶液，将工作储备溶液用水和50 μL空白尿样配制成所需浓度的基质标准系列溶液。甲醇(质谱级，德国Merck公司)，乙酸铵(色谱纯，美国Tedia公司)。实验用水为屈臣氏瓶装蒸馏水。

1.2 色谱及质谱条件

1.2.1色谱条件色谱柱：Waters ACQUITY UPLCR®HSS T3色谱柱(50×2.1 mm，1.8 μm)；流动相：A为0.002 mol/L乙酸铵水溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序为：0～2 min，5%B;2～4 min,5%～95%B；4～6 min，95%B；6～8 min，95%～5%B；8～10 min，5%B。流速：0.2 mL/min；进样体积：10.0 μL；柱温：40 ℃；样品室温度：25 ℃。

1.2.2质谱条件扫描方式：电喷雾电离源(ESI-)扫描 ；采集模式：多反应监测(MRM) 模式；碰撞气压力(CAD)：4 Pa；气帘气压力(CUR)：30 Pa；雾化气压力(GS1)：65 Pa；辅助气压力(GS2)：65 Pa；入口电压(EP)：-10 V；碰撞室出口电压(CXP)：-15 V；喷雾电压：-4 500 V；气化温度：400 ℃。定量和定性离子、碰撞能量等参数见表1。

表1 3种化合物的保留时间、相对分子质量和优化质谱的分析参数

* Quantification ion,DP:Declustering potential,CE:Collision energy.

1.3 样品制备

尿液样品采集之后，置于冰箱中-20 ℃冷冻，用时取冰冻尿样于室温下缓慢解冻后，置于高速离心机中,以5 000 r/min离心5 min。取上清液过0.22 μm水相滤膜。取滤液50 μL加950 μL水混匀，进行UPLC-MS/MS分析。如样品浓度过高可将样品稀释适当倍数后进行测定。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的优化

考察了Waters ACQUITY UPLC®C18和Waters ACQUITY UPLC®HSS T3 两种色谱柱，根据峰形和分离度最后选择Waters ACQUITY UPLC®HSS T3柱。以甲醇和乙酸铵水溶液为流动相，在水中加入0.002 mol/L乙酸铵有助于待测物良好峰形的形成，并能增强检测的灵敏度。对三种物质的混合基质标准溶液进行分析，甲醇相起始比例为5%，最终比例为95%，运行10 min，梯度洗脱，可以实现三种物质和尿液中干扰成分的分离。待测物的离子流色谱图如图1所示。

2.2 质谱条件的优化

2.2.1定性、定量离子的选择根据3种化合物的结构特征，选择负离子模式电离，采用流动注射泵进样，分别对质量浓度为1.0 mg/L的甜蜜素、糖精钠和安赛蜜标准溶液进行一级质谱扫描，确定其准分子离子峰，并分别优化其去簇电压。分别以其准分子离子为母离子，通过碰撞气碰撞产生碎片离子进行二级质谱扫描，同时优化碰撞电压，选择丰度较高的2种碎片离子作为定性与定量特征离子。通过试验优化，3种化合物的定性与定量特征离子及优化的质谱参数见表1。

2.2.2分析物的子离子产生途径从甜蜜素的化学结构式可以看出它主要是由环己基和氨磺酸基两部分构成，图2中碎裂途径表明，甜蜜素在流动相乙酸铵的作用下脱去Na+形成m/z178.0母离子，环己基氨基磺酸负离子有两种裂解方式，一种是N-S单键的断裂脱去环己基氨基形成m/z79.9 SO3分子，另一种是C6H11-N键断裂脱去环己基形成m/z95.9子离子。

从安赛蜜的化学结构式可以看出它是一个六元杂环化合物，图2中碎裂途径表明，安赛蜜在流动相乙酸铵的作用下脱去K+形成m/z162.0母离子，母离子有两种裂解方式：一种为N-S和C-O两个单键的断裂脱去一个SO3分子m/z82.0子离子；另一种方式为O-S和C-N两个单键的断裂脱去一个四元环酯化合物形成m/z78.0子离子。

糖精钠的碎裂途径表明，糖精钠在流动相乙酸铵的作用下脱去Na+形成m/z182.0母离子，母离子有两种裂解方式；一种为C-S和C-C两个单键的断裂脱去一个C6H4基团形成m/z106.0 子离子；另一种是N-S和C-C两个单键的断裂脱去一个C6H4基团和一个SO2分子形成m/z42.0子离子。

2.3 样品前处理

糖精钠、安赛蜜和甜蜜素三种人工合成甜味剂以原型存在于尿液中，且他们具有很好的水溶性，本方法采用冷冻离心后直接用水稀释后直接测定。因取样量少，基质效应影响不大，方法灵敏度能够满足。

2.4 线性范围和检出限

向空白尿样中加入系列混合标准溶液，在优化条件下测定，以定量离子的峰面积比(Y)为纵坐标，质量浓度为横坐标X(μg/L)进行线性回归分析。三种化合物的相关系数大于0.99。化合物检出限(LOD)为样品阴性基质中添加标准品的方式获得(S/N≥3)，定量限(LOQ)为样品阴性基质中添加标准品的方式获得(S/N≥10)，结果见表2。

表2 3种物质的线性方程和检出限

Y:response value of quantitative ion of analyte;X:mass concentration of analyte,μg/L.

2.5 回收率、精密度和基质效应

取空白尿样进行加标回收和精密度实验。样品中甜蜜素和安赛蜜添加浓度分别为50、150、450 μg/L，样品中糖精钠添加浓度为500、1 500、4 500 μg/L。每个添加水平样品平行测定6次，计算回收率和精密度。在不同的添加水平下，平均回收率为99.0%～113%，相对标准偏差(RSD)为1.25%～1.78%。另外取50 μL空白样品加标准溶液配成甜蜜素和安赛蜜均为1 mg/L，糖精钠为10 mg/L的混合标样测定，计算样品的基质效应(表3)。结果表明本方法结果准确，可以满足定量要求。

表3 加标回收率、RSD和基质效应(n=6)

2.6 实际样品测定

应用本方法测定了200份小学生尿样，样品中甜蜜素检出率为93%，检出浓度在0.015～200 mg/L之间；糖精钠检出率为52%，检出浓度在0.10～41.4 mg/L之间；安赛蜜检出率为64%，检出浓度在0.010～96.6 mg/L；3种甜味剂都未检出的样品只有6份，检测结果显示3种甜味剂在小学生尿液中存在较为广泛，其中甜蜜素更为普遍。甜蜜素的检测结果为本研究进一步检测尿样中甜蜜素代谢物环己胺提供了信息。

3 结论

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱法快速测定人体尿液中3种合成甜味剂，该方法灵敏度高、选择性好、前处理方法简单，线性关系、回收率和重现性等方法学指标较好，分析时间短，仅用时10 min 即完成，为人体尿液中3种人工合成甜味剂的快速检测提供了一个可靠的方法。