肝肺同治祛风方治疗咳嗽变异性哮喘模型大鼠的疗效观察*

王文丽，李冬梅，施　雷

（1.辽宁中医药大学附属医院儿科，沈阳　110032；2.沈阳市皇姑区中医院，沈阳　110032）



·实验研究·

肝肺同治祛风方治疗咳嗽变异性哮喘模型大鼠的疗效观察*

王文丽1，李冬梅1，施雷2

（1.辽宁中医药大学附属医院儿科，沈阳110032；2.沈阳市皇姑区中医院，沈阳110032）

［目的］观察肝肺同治祛风法对咳嗽变异性哮喘（CVA）大鼠模型的疗效。［方法］将72只大鼠分为正常对照组、模型对照组、激素吸入组、清肺祛风组、清肝熄风组、肝肺同治组，制备咳嗽变异性哮喘肝郁肺虚病证结合大鼠模型，观察各组大鼠一般状态、肺支气管病理组织形态、支气管肺泡灌洗液（BALF）嗜酸性粒细胞计数及测定血清IgE水平的变化。［结果］与正常对照组比较，模型对照组CVA大鼠支气管管腔狭窄，黏膜增厚，支气管壁及可见大量嗜酸性粒细胞浸润，BALF涂片EOS计数显著升高，血清中IgE的含量显著升高，与正常对照组比较均有显著性差异（P＜0.01）。激素治疗组及各中药治疗组，各项指标均有显著改善，与模型组比较有显著性差异（P＜0.01），以激素治疗组及肝肺同治组指标改善最为显著。［结论］肝肺同治法可改善肝郁肺虚的中医证候，降低CVA模型大鼠慢性气道炎症反应，调整免疫异常。

咳嗽变异性哮喘；大鼠；肝郁肺虚；肝肺同治；IgE

咳嗽变异性哮喘（CVA）是以反复发作的慢性咳嗽为特征的一种特殊类型哮喘，儿童患病率为0.77%～5.0%［1］。由于CVA的临床表现不典型，缺乏特异性，常被忽视或误诊，可能会给予抗生素长期治疗而疗效不佳［2］。有研究发现其复发率较高达30%，可能与患者经常接触过敏原有关［3］。CVA发病迅速、阵发性、易反复发作等特点与风邪为“百病之长，善行数变”、“其性轻扬，风盛则挛急”的特点相似。外风责之于肺，内风责之于肝，肝郁肺虚，木火刑金，肝肺同病则发为咳嗽。中医药在防治儿童CVA方面具有独到优势，可以弥补西医治疗的不足［4］，本研究通过观察自拟肝肺同治祛风方对CVA模型大鼠气道慢性炎症的作用，观察其改善气道慢性变态反应性炎症的效应，探讨从风论治CVA作用机制。

1　材料与仪器

1.1动物4周龄雄性SPF级SD大鼠72只，体质量（100±10）g，辽宁长生生物技术有限公司（许可证编号：［动］SCXK（辽）2010-0001）。

1.2试剂卵蛋白（ovalbumin OVA）：Sigma公司，GradeII；氢氧化铝的生理盐水溶液沈阳市试剂三厂（批号：080714）；辣椒素溶液：上海紫一试剂公司（批号：20110514）；IgE酶联免疫试剂盒：（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3药物普米克令舒（吸入用布地奈德）：葛兰素史克制药（重庆）有限公司，国药准字H20010389，购于辽宁中医药大学附属医院西药局。清肺祛风方（黄芩、荆芥、蝉蜕、防风、甘草），清肝熄风方（地龙、钩藤、白芍、五味子、甘草），肝肺同治方（黄芩、荆芥、蝉蜕、防风、地龙、白僵蚕、钩藤、白芍、五味子、麦门冬、甘草）诸药材，购于辽宁中医药大学附属医院中草药局，经药师鉴定为道地药材。常规水煎煮，浓缩为每毫升1 g生药溶液，备用。

1.4仪器透明雾化吸入箱，自制；INQUA NEBplus型压缩雾化吸入机，INQUA GmbH公司，德国；精密转轮切片机（LEICA RM2135）；系统生物显微镜（OLYPUS BX50F4）。

2　方法

2.1造模与分组采用随机数字表法将72只大鼠分为正常对照组、模型对照组、激素吸入组、清肺祛风组、清肝熄风组、肝肺同治组，每组均12只。清洁动物房内室温下常规饲养7 d，自由食水，记录各组大鼠体质量、呼吸、进食水量、肛温情况。

造模方法：卵蛋白氢氧化铝致敏激发CVA大鼠，烟熏方法复制肺气虚大鼠模型［5］，长期激怒法建立肝气郁结、肝火犯肺动物模型［6-7］，采用复合因素建立CVA肝郁肺虚病证结合动物模型［8］。

2.2给药造模第16日，第1次卵蛋白生理盐水溶液雾化激发次日开始给药，雾化攻击前30 min灌胃给药，非雾化日常规给药，连续给药15 d。中药治疗组每日灌胃等效剂量中药复方［9］，每日每千克体质量12 g生药量，每日1次，共15 d。正常对照组、模型对照组及激素治疗组灌胃等量生理盐水。激素治疗组大鼠放入透明雾化箱中，喷入普米克令舒生理盐水溶液，吸入量为0.6 mL/kg体质量，浓度为20%，每日1次，共15 d。

2.3标本处理造模第30天，辣椒素激发引咳试验后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，打开胸腔，心脏穿刺取血，置于普通试管，静置30 min，取上层血清，-80℃保存备用。结扎右主支气管，分离右肺上、中、下叶，右肺中叶置于新鲜配制的中性4%多聚甲醛固定液中。

支气管肺泡灌洗液（BALF）回收：以眼科剪在气管上剪一斜口，插管，把针头和气管一起固定结扎，左肺肺泡灌洗，分别取0.8、0.8、0.5 mL，0.01 mol/L PBS依次灌洗3次，灌洗液回收率＞90%。BALF于1 500 r/min离心10 min，细胞沉淀用1 mL PBS重悬，取约30 μL细胞悬液，甩片晾干，95%的乙醇固定，常规HE染色，光镜下进行细胞分类计数。计数200个细胞，得出嗜酸性粒细胞数量。

2.4观测指标大鼠一般状态观察、肺支气管病理组织形态学观察、BALF嗜酸性粒细胞计数、ELISA法检测血清IgE含量。

2.5统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行录入及分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，以P＜0.05认为差异有统计学意义。

3　结果

3.1大鼠一般状态观察造模前各组大鼠体质量、呼吸、进食水量、肛温等情况基本一致，无统计学差异。正常对照组大鼠体质量稳定增长，呼吸平稳，行动灵活，反应灵敏，毛色光泽。模型组体质量增长明显减慢，各治疗组体质量较模型组增长明显，但仍低于正常对照组。模型组及各治疗组雾化激发后出现烦躁不安、拱背蜷缩，皮毛黄湿无光泽，时有脱落，消瘦，呼吸急促、咳嗽喘息等症状。

3.2大鼠肺、支气管形态学检测正常对照组肺内各级支气管结构正常，支气管壁及其周围组织结构清晰，支气管管壁和平滑肌厚度正常，支气管上皮细胞完整，管腔内无脱落细胞，间质内无炎症细胞浸润。肺泡上皮完整，肺泡壁毛细血管无充血、缺血，肺泡腔内清洁无渗出，可见少量嗜酸性粒细胞。模型对照组支气管管腔狭窄，黏膜增厚，支气管上皮纤毛倒伏、缺失，上皮细胞脱落。肺泡腔增大，肺泡间隔及气道平滑肌明显增厚，细支气管管腔扩大，黏液分泌增多，可见大量嗜酸性粒细胞浸润。与模型组比较，各治疗组支气管组织病理变化明显减轻，激素治疗组、肝肺同治组织病理改善更明显。见图1。

图1　大鼠肺、支气管组织病理（HE染色×200）Fig.1　Pathology figure of lung and bronchia in rats（HE×200）

3.3BALF细胞计数与正常对照组比较，模型对照组BALF涂片EOS计数显著升高（P＜0.01）；与模型对照组相比，各治疗组EOS计数明显降低，有统计学差异（P＜0.01），其中以激素治疗组、肝肺同治组降低最明显。见表1。

表1　BALF嗜酸性粒细胞（EOS）计数（±s）Tab.1　BALF EOS count（±s）

表1　BALF嗜酸性粒细胞（EOS）计数（±s）Tab.1　BALF EOS count（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01。

组别　动物数　EOS（个/200个细胞）正常对照组　12　1.55±1.23模型对照组　11　32.46±5.62*激素治疗组　12　7.58±4.55*#清肺祛风组　12　12.48±2.56*#清肝熄风组　12　15.62±5.74*#肝肺同治组　12　8.32±3.47*#

3.4ELISA法检测大鼠血清中IgE含量与正常对照组比较，模型对照组IgE含量显著升高（P＜0.01）；与模型对照组相比，各治疗组IgE的含量明显降低，有统计学差异（P＜0.01），其中以激素治疗组、肝肺同治组降低最明显。见表2。

表2　ELISA法检测大鼠血清中IgE的含量（±s）Tab.2　Detection IgE of serum in rats by ELISA（±s）

表2　ELISA法检测大鼠血清中IgE的含量（±s）Tab.2　Detection IgE of serum in rats by ELISA（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01；与激素治疗组比较，△P＜0.05。

组别　动物数　IgE（U/mL）正常对照组　12　6.53±1.25模型对照组　11　21.22±2.01*激素治疗组　12　9.58±1.46#清肺祛风组　12　15.48±1.95#△清肝熄风组　12　13.45±2.11#△肝肺同治组　12　10.26±1.64#

4　讨论

CVA传统中医病因病机为为宿痰伏肺、复感外邪，遇外感引触［10］，《景岳全书》［11］指出：“喘有夙根，遇寒即发，或遇劳即发者，亦名哮喘。”《普济本事方》［12］中述“此症有苦至终身者，亦有母子相传者”。CVA表现为反复发作的刺激性干咳，具有阵发性、痉挛性的特点，常伴有鼻塞、流涕、鼻痒等症状［13］，与中医“风”发病迅速、“善行而数变”、“风盛则痒”的致病特点相符，提示风邪是本病发生、发展和演变过程中主要致病因素［14］。小儿为稚阴稚阳之体，素体肺虚易感外风，CVA病初患儿见鼻塞、咽痒、流涕、鼻痒，为外风袭肺；内风者，乃肝木化风所致，小儿素体肺常不足、肝常有余，既有金行的虚弱不足，又有木行的过于亢盛，则肺金易被肝木反克。素体阴虚，水不涵木，阴虚风动而内风上扰，木叩金鸣而咳。CVA患儿先天禀赋不足，具有特应性体质，易生风化痰。《读医随笔》［15］曰“凡病之气结……哮喘，皆肝气不能舒畅所致也。”李彦君等［16］也认为，一旦感受风寒之邪气，外风引动内在的伏风，内外之邪相合，导致肺失宣降，发生CVA。所以，CVA患儿常由于治不得法而外邪不解，邪郁于肺，引动内风，风动上扰，内外风相合则金钟动摇，宣肃失司，发为咳嗽［17］。

本研究以卵蛋白氢氧化铝致敏激发CVA大鼠，模型大鼠出现呼吸急促、烦躁、咳嗽、前肢缩抬、腹肌收缩、可闻及哮鸣音等呼吸道痉挛症状，符合CVA临床特点［18］。以中医五行生克制化理论为依据，模拟中医传统病因，选择幼龄大鼠，取其幼龄肺常不足，烟熏致肺气益虚，易感外风；幼鼠素体阴常不足、阴液亏虚，长期激怒使肝气郁结，肝木化风，木火刑金，肺虚肝旺。模型大鼠烟熏过程中，逐渐出现精神萎靡、食量减少、体质量增长缓慢、间断咳嗽，提示肺虚；大鼠烦躁不安，抓咬模具，易激惹，自发活动增多提示肝气郁结，肝阳上亢；呼吸急促，无刺激状态下咳嗽次数较正常组增多提示肝气犯肺，肝阳化风。

在辨证论治的基础上，依据方剂的功效或其组成药物的功效推测或反证其对应证候的属性［19-20］，即为以方测证。本CVA肝肺通病证候病位在肺，病本在肝，应重在肝肺同治，故用自拟肝肺同治方。以黄芩、荆芥、蝉衣、防风清肺止咳化痰；地龙、僵蚕、钩藤清肝泻火、止咳平喘，白芍、五味子、麦冬、甘草养阴柔肝。内外合治，使肝火不刑肺金，则肺宣肃复常，咳嗽自止。研究结果显示，肝肺同治祛风法可以减轻大鼠气道嗜酸性粒细胞浸润、大鼠气道病理组织变化及降低血清IgE水平。尤其在改善肝火犯肺的中医证候方面，明显优于激素治疗组，提示中医辨证治疗即可以有效改善患儿气道慢性炎症反应，同时可能改善CVA患儿烦躁、多动等的中医证候，提高患儿生存质量。

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（本文编辑：马英，于春泉）

Observation on the curative effect of eliminating wind prescription of treatment lung and liver together in CVA rats

WANG Wen-li1，LI Dong-mei1，SHI Lei2
（1.Department of Paediatrics，The Affiliated Hospital of LiaoningUniversity of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；2.Huanggu District Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China）

［Objective］To investigate the curative effect of eliminating wind prescription of treatment lung and liver together in CVA rats. ［Methods］The combination of disease and syndrome animal model of CVA rats was established by traditional Chinese medicine（TCM）etiology and Western medicine etiology pathology，then they were randomly divided into normal group，model group，hormone inhaling group，clear lung heat and eliminating wind evil method group，clear liver to stop wind group，both lung and Liver treatment group. Observation the rat general state，spontaneous activity，cough response，bronchial lung pathology organization form，bronchoalveolar lavage fluid（BALF）eosinophil count and serum IgE.［Results］Comparison with normal rats，the bronchial lumen of the model group rats were stenosis，mucosal thickening，numerous eosinophils infiltration on bronchial wall，the EOS counting was significant rise in BALF smear，the content of serum IgE was significantly increased（P＜0.01）.Comparison with model rats，bronchial lung pathology，the EOS counting and serum IgE content of hormone inhaling group and TCM treatment group were significantly increased（P＜0.01），especially the hormone inhaling group and treating both lung and liver group.［Conclusion］Treating lung and liver together could significantly improved the TCM syndrome of liver depression and lung deficiency，reduced the chronic airway inflammation of CVA model rats and regulate the immune abnormalities.

cough variant asthma；rat；liver depression and lung deficiency；treating lung and liver together；IgE

R562.25

A

1672-1519（2016）08-0472-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.08.08

2016-03-30）

辽宁省教育厅科学技术研究一般项目（L2013368）。

王文丽（1974-），女，博士研究生，副主任中医师，研究方向为中医药防治小儿咳喘病证研究。